髓质脊髓三叉神经核文献阅读笔记

文献阅读

1.RNA-seq

对于大量RNA测序，收集第30天的类器官。使用FastPure细胞/组织总RNA分离试剂盒根据制造商的方案提取总RNA。采用Nanodrop 2000分光光度计测定RNA浓度和纯度。使用Agilent 2100生物分析仪和2100 RNA纳米6000检测试剂盒评估RNA样品的完整性。简单地说，对于样品C3、C4、C6和C9 (hmSpVO_rep1)，使用TruSeq搁浅mRNA LT Sample Prep Kit构建文库，并在Illumina HiSeq X Ten平台上测序。对hmSpVO_rep2和hmSpVO_ventr样品，采用TIANSeq mRNA Capture Kit制备mRNA，采用TIANSeq Fast RNA Library Kit构建文库。文库在Illumina NovaSeq 6000上测序。
使用STAR v2.7.10a、44将Clean reads与参考基因组(GRCh38)对齐，使用RSEM v1.3.145对每个基因的reads进行计数，计算外显子模型每千碱基每百万mapping reads (TPM)的转录本。我们通过nf-core/rnaseq管道v3.13.2.46实现了这一点，以相同的方式处理hESC和hCO的原始数据。转录组相似性分析采用单样本GSEA方法47，使用GSVA (v 1.44.5) R包，富集评分采用最小-最大尺度进行可视化。背侧和腹侧富集得分的归一化差异被视为背侧特征得分。组织特异性基因列表来自GTEx数据库。大脑区域特异性基因通过voxhunt软件包计算得到前20个基因的特征。

2.ScRNA-seq

对于单细胞RNA测序，收集第30天和第62天的hmSpVOs并将其分离成单细胞。简单地说，6-8个同阶段的hmSpVOs汇集在一起。500 g离心5 min后取出培养基，加入1 ml培养液;类器官用剪刀轻轻切开，并在37℃的金属浴中消化。500 g离心悬浮液5分钟，去除上清，加入1 ml胰蛋白酶，37℃继续消化。C 15- 30min。完全消化后，细胞通过40 mm筛，用DPBS+10% BSA洗涤2-3次进行进一步实验。

为了质量控制，细胞存活率应在80%以上。按照制造商的方案，将细胞以每ml 1000个细胞的浓度(Single Cell 30 library V3)加载到10X Chromium单细胞平台(10X Genomics)上。根据需要收获的细胞数量，构建GEMs (Gel Bead in Emulsion)进行单细胞分离。GEMs形成后，收集GEMs在PCR机中进行反转录标记。然后对gem进行油处理，用磁珠纯化扩增后的cDNA，进行cDNA扩增和质量检测。利用质量合格的cDNA构建3′基因表达文库。经过片段化、接头连接、样本索引PCR等步骤，文库在Illumina Novaseq 6000仪器上进行定量检测和测序，末端reads为150碱基对。

为了获得计数矩阵，使用默认参数的Cell Ranger (v 6.1.2)将reads与人类基因组GRCh38 (v 3.0.0，由10X genomics提供)对齐。下游分析使用R软件包Seurat (v4.3.0)进行。3为了质量控制，将检测到的基因在500 ~ 5000之间，UMI计数在4000 ~ 20000之间，线粒体基因比例<10%的细胞作为高质量细胞。使用DoubletFinder (v 2.0.3)40检测并删除双元。计数通过该细胞的总表达归一化，乘以1万的比例因子，并进行对数变换，然后检测前2000个高度可变的基因(Seurat中的NormalizeDataand FindVariableFeatures功能)。

对于数据集成和注释，在SeuratWrappers包(v 0.3.1)中使用MNN方法49去除了批处理效应。

在缩放基因表达和执行降维后，我们使用均匀流形逼近和投影(UMAP)嵌入可视化细胞。前20个维度用于识别单元和集群的邻居，分辨率为1。用规范标记标记聚类注释。我们首先根据神经元标记物(STMN和DCX)和早期神经发生标记物(SOX2和NES)的表达情况对神经元和非神经元集群进行分类。然后，将非神经元细胞群分为表达SOX2的神经祖细胞群(NPC)和表达NHLH1和INA50的中间祖细胞群(IP)。神经元簇分为兴奋性神经元簇(ExN，表达SLC17A6)、抑制性神经元簇(InN，表达GAD1、GAD2和SLC32A1)和未成熟神经元簇(IM，不表达神经元类型特异性标记物)。

我们使用在Seurat中实现的基于锚定的标签转移，将转录组相似性与已发表的发育中的人脑(5-14孕周后(pcw)) scRNAseq数据23进行比较。要做到这一点，我们首先随机抽取100k个细胞，并使用每个供体作为参考数据集的批处理因子与IntegrateData函数进行集成。然后，使用具有前30个维度的FindTransferAnchors函数识别和过滤查询和参考数据集之间的锚。然后，使用TransferData函数计算预测分数。用热图显示细胞类型和区域相似性(定义为每种细胞类型的平均预测分数)。我们进一步使用MapQuery函数将我们的数据投影到参考的UMAP图上。
为了检验样本的区域一致性，我们使用voxhunt R软件包对成熟神经元簇(ExN和InN)进行无偏空间映射，然后在矢状视图或柱状图中绘制脑区域相似性。为了计算单细胞转录组与髓质背-腹侧亚区的空间相关模式，我们使用AUCell软件包(v 1.18.1)计算每种细胞类型的富集评分，然后进行z缩放以进行可视化。

为了评估具有不同髓核的hmSpVOs的转录组相似性，我们使用与上述相同的方法计算富集分数。使用Allen Brain人脑微阵列数据集(https://human.brain-map.org)(年龄范围为24 ~ 57岁)，选择前20倍变化且p<0.05的基因作为每个细胞核相对于其他细胞核的基因签名(表S3)。来自同一核的左右半球的数据被合并进行分析。

为了了解潜在的亚核特异性特征，我们分析了Vo (MAFB和FN1)， Vi (IRX2, KCNG4, PDE1C和ZBTB16)和Vc (TAC1, BAIAP3, CAMK2A, CALB2和CALB1)的相对基因表达，分别为ExN和InN绘制了最小-最大缩放对数(每10 k+1计数)。

我们使用默认参数的monocle3包(v 1.3.1)51进行轨迹分析，并选择NPC集群作为根节点来排序细胞。采用ggridge (v . 0.5.4)软件包对不同细胞类型进行伪时间脊线绘制。利用ClusterGVis (v 0.1.0)软件包绘制感兴趣基因的伪时间热图。我们还使用scvelo (v0.2.5)43进行了RNA速度分析，scv.tl.velocity函数为“随机”模式，并计算了速度时间来表示分化轨迹。

为了直接比较hmSpVOs与其他区域特异性脑类器官，我们使用harmony (v 0.1.1)整合了来自hCOs(晚期，72天和79天)、8个hThOs(晚期，89天)、12个和hmSpVOs的单细胞RNA-seq数据。4归一化后，使用前2000个变量特征对数据进行缩放并进行主成分分析(PCA)。基于前20个pc，使用默认参数的RunHarmony()函数对Organoids数据集进行整合，利用前20个维度识别细胞和集群的邻居，分辨率为1.8。如上所述，定义了神经元和非神经元簇。我们集中在神经元簇上进行进一步分析。标记阳性细胞为标记基因计数大于0 /总神经元细胞的细胞。使用带有logfc的Seurat中的FindMarkers()函数执行差异分析。阈值= 0参数使用Wilcox测试。以log2倍变化> log2(1.2)、调整p值< 0.01、差异绝对值(pct.1pct.2) > 0.1为差异有统计学意义。

3.GEO数据

4.hmSpVOs产生

与转录组分析一致，hmSpVOs未显示明显的OLIG3+类A谱系或标记NKX6-1、PHOX2B或NKX2-2的腹侧谱系的生产。此外，在hmSpVOs中未检测到SOX10阳性的神经嵴谱系，类似于hThOs和hCOs。

在较长时间的培养后（第30天），hmSpVOs中生成了大量LMX1B+细胞和PAX2+/LHX1/5+细胞，这表明了与SpV相关的兴奋性和抑制性神经元谱系的发展。通过免疫染色用兴奋性标记物囊泡型谷氨酸转运蛋白2（vGLUT2）和抑制性标记物γ-氨基丁酸（GABA）验证了LMX1B+和PAX2+细胞的身份。

值得注意的是，同源域因子LBX1，其标记延髓中的类B神经元，并决定SpV中中继神经元的体感命运，也在hmSpVOs中广泛表达，而在hThOs或hCOs中则未见。正如我们之前报告的， hCOs和hThOs分别生成TBR1+皮质神经元和TCF7L2+丘脑神经元，这在hmSpVOs中几乎未见生成，这再次表明了hmSpVOs的区域身份独特性。

除了来自H9 hESCs的hmSpVOs外，来自H1 hESCs和hiPSC系RC01001A和RC01001B的hmSpVOs也显示了类似的谱系发展，并且定量分析表明，与hThOs和hCOs相比，从所有细胞系派生的hmSpVOs中特异生成了丰富的PAX2+和LMX1B+细胞，这表明了不同hPSC系中hmSpVO生成的可靠性。