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基序对酶特异性功能的影响-文献精读67

article 2024/10/22 6:11:02

Substrate specificity of a branch of aromatic dioxygenases determined by three distinct motifs

一支芳香二氧化酶的底物特异性由三个不同的基序决定

摘要

底物尺寸特异性的逆转是蛋白质进化中的一个障碍。Duf4243二氧化酶GedK和BTG13已知能够催化大体积三环羟基苯的芳香裂解。在本研究中，我们发现了一种Duf4243二氧化酶PaD，它偏好来自青霉酸生物合成途径的小单环羟基苯。PaD与GedK和BTG13的序列比对显示，PaD在蛋白质序列的不同位置有三个额外的基序，分别称为基序1-3。PaD与底物结合的高分辨率X射线晶体结构表明，基序1-3决定了三个环（环1-3）的形成。最引人注目的是，这三个环在口袋顶部堆叠在一起，形成一个盖状的三级结构，带有狭窄的通道和明显收缩的入口。这显著改变了底物特异性，通过决定更小底物的进入和结合方式。进一步的基因组挖掘表明，具有基序1-3的Duf4243二氧化酶属于一个进化分支，广泛参与天然产物的生物合成，并具有降解多种单环羟基苯污染物的能力。本研究展示了天然酶如何通过引入新的小基序，在保持总体架构不变的情况下，根本改变底物特异性。这也为酶的底物特异性工程提供了理论基础，并为具有独特底物特异性的芳香二氧化酶的鉴定提供了指导。

引言

芳香环在原料中是普遍存在的结构，但它们的芳香性使其在温和的反应条件下不易发生反应。迄今为止，只有少数在苛刻条件下进行的有机反应能够直接裂解芳香环的碳-碳键【1,2】。另一方面，自然界利用芳香二氧化酶进行微生物苯酚代谢【3,4】，包括内双氧酶、外双氧酶、对苯二酚双氧酶和2,5-羟基吡啶双氧酶（图1a）。这些二氧化酶降解小型单环芳香中间体【3】，这是芳香烃生物降解中的关键步骤（图1a）。芳香二氧化酶能够克服由芳香性带来的稳定共振能量，将外周代谢途径生成的不同芳香中间体转化为β-酮戊二酸和进入三羧酸循环的中间体【5】。例如，假单胞菌Pseudomonas fluorescens ACB中的4-羟基乙酰苯代谢途径涉及一种非血红素铁(II)依赖的对苯二酚双氧酶HapCD【4,6】。近年来，真菌芳香二氧化酶得到了表征，因为真菌是自然界中木质素生物降解的重要成员【3】。例如，黑曲霉（Aspergillus niger）中已经表征了内双氧酶、原儿茶酸双氧酶和对苯二酚双氧酶【7,8】。

a. 内双氧酶、外双氧酶、对苯二酚双氧酶和2,5-羟基吡啶双氧酶催化的芳香环裂解反应。 b. 之前研究提出的青霉酸的生物合成途径。一个不还原型聚酮合酶（NR-PKS）生成奥氏酸（OA, 2），接着由脱羧酶和甲基转移酶催化形成对苯二酚4（6-甲基苯-1,2,4-三醇）。 c. 不同Duf4243二氧化酶的底物特异性转变及其对应的底物。BTG和GedK催化三环对苯二酚的氧化环开裂，而PaD接受单环对苯二酚。

除了在代谢中的作用，芳香裂解还被提出作为真菌天然产物生物合成的一个宝贵策略【9,10】。最近，两个含有DUF4243结构域的二氧化酶BTG13和GedK分别从真菌天然产物贝地考林和吉欧丁的生物合成途径中得到表征，它们被报道通过对苯二酚裂解催化蒽醌的环开裂【11,12】（图1c）。值得注意的是，BTG13的反应位点由非典型的铁配位构建，包含四个组氨酸残基、不寻常的羧化赖氨酸和水。对苯二酚裂解还参与了真菌四氢呋喃酸聚酮类化合物的生物合成，如青霉酸（PA, 1，图1b）、瘟毒素、结节菌酸、劳登酸等，这些化合物都表现出多样的生物活性【9,13】。

青霉酸（PA），一种著名的乳酸毒素，由超过100种真菌产生，于1913年首次被发现并命名【14,15】。虽然青霉酸以其作为致癌性食品和饲料污染物而广为人知，但它还展示出抗菌、抗病毒和抗利尿的药理特性及植物毒性【14,16,17,18】。青霉酸对家禽和牲畜具有毒性，甚至可能通过食物链传播而对人类产生危害，因为它是霉变饲料中的主要真菌毒素之一【19】。对其生物合成的了解将有助于减少霉菌毒素污染。初步的14C标记物质饲养实验表明奥氏酸（OA, 2）和1-4-二羟基-6-甲氧基-2-甲基苯（4）是中间产物（图1b和补充图1）【20,21】。然而，1的详细生物合成途径以及芳香环开裂机制仍不明确。

在本研究中，通过靶向基因敲除、底物互补和生化表征，描述了A. westerdijkiae中1的生物合成基因簇（BGC）和生物合成逻辑。我们发现一个含有DUF4243结构域的二氧化酶PaD催化了小型单环对苯二酚的芳香裂解，这与已报道的Duf4243二氧化酶GedK和BTG13不同。通过对PaD和BTG13的晶体结构分析和突变研究，探讨了底物特异性的结构基础。

结果

pa BGC的鉴定

尽管科学家在100多年前就发现了青霉酸（PA），但pa BGC（青霉酸生物合成基因簇）仍然未知。我们从西尔德氏曲霉（Aspergillus westerdijkiae）中分离了1，并通过将其核磁共振（NMR）光谱与已报道的数据进行比较确认了其结构（补充图17-18）【22】。先前的生物遗传分析和标记研究表明，奥氏酸（OA, 2）【23,24】、6-甲基-1,2,4-苯三醇（3）和1,4-二羟基-6-甲氧基-2-甲基苯（4）是该途径的中间产物（图1b）【20,23】。先前提出的生物合成途径表明，pa BGC中应编码一个负责OA生物合成的非还原型聚酮合酶（NR-PKS）、一个假定的氧化脱羧酶和一个甲基转移酶【20,23】（图2f）。

a. A. westerdijkiae 中青霉酸 (1) 生物合成基因簇 (BGC)。NR-PKS，非还原型聚酮合酶；FMO，含黄素的单加氧酶；OMeT，O-甲基转移酶；SDR，短链还原酶；MFS，主要促运蛋白超家族；TF，转录因子。 b. 西尔德氏曲霉野生型及突变体（ΔpaA、ΔpaD 和 ΔpaE）的产物谱。 c. PaB 和 PaC 对 2 的体外分析。 d. PaD 对 4 或 8 的体外分析。 e. 含有 paD 和 paE 基因的酿酒酵母喂以化合物 4 后的产物谱 LC-MS 分析。含空载体 pXW55 和 pXW06 的酿酒酵母作为对照。 f. 青霉酸 (1) 的拟议生物合成途径。

我们使用来自白僵菌的奥氏酸合酶 OpS1 作为查询，搜索了 pa BGC【25】，鉴定出了来自 A. westerdijkiae 基因组的六个编码 NR-PKS 的 BGC。对六个 BGC 进行筛选，最终发现了一个包含七个基因的候选 BGC。该簇编码了一个典型的 NR-PKS（PaA），一个依赖黄素的羟化酶（PaB），一个O-甲基转移酶（PaC），一个含有 DUF4243 结构域的蛋白（PaD），一个短链脱氢酶/还原酶（SDR, PaE），一个主要促运蛋白超家族转运蛋白（PaF），以及一个转录调控因子（PaG）（图2a 和补充表3）。进一步对其他产生青霉酸的真菌的基因组挖掘显示了许多与 pa 基因簇同源的 BGC（补充图2）。

PaA 是一个典型的 NR-PKS，由起始单元酰基转移酶 (SAT)、酮合酶 (KS)、酰基转移酶 (AT)、产物模板 (PT)、双酰基载体蛋白 (ACP) 和 N 端硫酯酶 (TE) 结构域组成（补充图3）【26】。PaA 的结构域组织与已报道的奥氏酸合酶相似（补充图3）。当我们通过双交换重组敲除 paA，使用潮霉素抗性基因 hyg 作为标记（补充图4）时，突变体失去了青霉酸 (1) 的生产能力（图2b）。此外，通过用化合物 2 对 ΔpaA 进行化学互补，青霉酸的生产得以恢复（补充图5）。所有这些结果确认了： i) 鉴定出的 pa 基因簇负责青霉酸的生物合成； ii) PaA 负责第一个生物合成中间体奥氏酸 (OA, 2) 的合成，这与之前的标记研究一致【23】。

表征化合物 4 作为对苯二酚裂解的底物

推测一个脱羧酶和甲基转移酶将聚酮合酶 (PKS) 产物 2 转化为 4，这被认为是对苯二酚裂解的底物 (图 1b 和补充图 1)【26,27】。因此，从大肠杆菌 BL21 中纯化了推测的脱羧酶 PaB (补充图 6)，并与化合物 2 和 FAD 一起孵育。该反应产生了两个新产物：6 (MW = 138) 和其推测的氧化二聚体 7 (MW = 274) (图 2c 和补充图 38)。由于 6 不稳定，无法分离出来，但从大规模反应中成功纯化了 7，并通过 NMR 数据进一步表征 (补充表 4 和图 23−26)。根据 7 的结构和 6 的质谱（比化合物 3 少两个单位），我们推测 6 是化合物 3 的自发氧化产物 (图 2f)，类似的氧化序列也存在于对卵孢菌酶的生化研究中【25】。因此，PaB 是一种氧化脱羧酶，可将 2 转化为 3。

为了证明 PaC 催化了 3 的甲基化 (图 2f)，我们从大肠杆菌 BL21 中纯化了 PaC (补充图 6)。由于 3 和 6 无法分离，我们使用化合物 2 与 PaB 和 PaC 共同孵育。然而，除了 6 和 7 之外，还观察到了一种新化合物 8，而不是 4 (图 2c)。NMR 和质谱表征证实 8 确实是 4 的 O-甲基化氧化产物 (补充图 27, 28)。因此，我们推测 PaC 催化 3 生成 4，由于其高度活跃的酚结构，4 自发氧化生成 8 (图 2f)。

为了确认 4 是 PaC 实际生成的产物，并且是随后的对苯二酚裂解的底物，我们对 pa BGC 中的其他基因进行了敲除。paD 敲除体积累了三种主要化合物：2、8 以及 PaC 反应中缺失的产物 4，这些都通过 NMR 表征验证 (图 2b 和补充图 21, 22)。正如预期的那样，在 PBS 缓冲液中可以观察到 4 自发转化为 8 (图 2d)，进一步确认了在体外反应中 4 氧化生成 8 的过程。将等量的 4 和 8 补充到 ΔpaA 中，1 的生成得以恢复。然而，补充 4 时的产量显著高于补充 8 (补充图 5)，提示 8 可能通过内源还原酶缓慢还原为 4，进而影响产量。最后，当我们将 2 与腺苷甲硫氨酸 (SAM) 和 PaC 一起孵育时，未检测到新产物 (图 2c)，排除了 PaC 的非特异性反应，确认了 PaB 和 PaC 的反应顺序生成 4，作为随后对苯二酚裂解的底物。

鉴定 PaD 为对苯二酚加氧酶

paD 基因敲除 (图 2b) 表明 PaD 催化 4 的对苯二酚裂解。为了确认 PaD 的作用，我们将 4 与从大肠杆菌中纯化的 PaD 一起孵育，无需添加任何辅因子。除了 8 之外，反应中还出现了一种新化合物 9 (图 2d)，通过 NMR 数据表征为无芳香性的内酯 (补充表 5 和图 29−32)。9 可能是由 PaD 生成的线性加氧产物 5 自发内酯化形成的 (图 2f)。实际上，将 9 补充到 ΔpaA 突变体中并不能恢复 1 的生产，但产生了末端醛还原的产物 10 (补充图 5, 33, 34, 42)，可能由内源还原酶介导。因此，PaD 通过加氧酶途径催化 4 的芳香环裂解。

最后，paE 基因敲除体也积累了大量的 10，表明 PaE 是 PaD 之后的直接酶。由于 5 无法分离，我们将 4 添加到含有 paE 和 paD 的酿酒酵母 BJ5464 中，以证明 SDR 样蛋白 PaE 的功能。全细胞转化清楚地显示了 1 的生成，表明 PaE 是一个双功能蛋白，负责还原和脱水 5 生成线性 1 (图 2e)。最终，线性 1 的自发环化在细胞内环境中形成环状 1。总之，我们完全阐明了青霉酸的生物合成途径，并鉴定了 Duf4243 加氧酶 PaD，催化了 4 的关键对苯二酚裂解。

由环 1−3（模体 1−3）组成的盖状三级结构在 apo-PaD 结构中的识别

鉴定 PaD 为对苯二酚加氧酶后，提出了其与最近表征的 GedK 和 BTG13 的区别。GedK 和 BTG13 也是 Duf4243 加氧酶，并在还原酶的协同作用下催化蒽醌 C4a−C10 键的裂解【11,12】。然而，与接受单环对苯二酚的 PaD 不同，BTG13 和 GedK 显示出对庞大三环对苯二酚的活性 (图 1c)。序列比对显示 PaD 与 BTG13/GedK 的相似度较低，身份率低于 30%。显著的是，比对显示 GedK 和 BTG13 缺少 PaD 中的三个独特模体：K56∼F60 (模体 1)、K246∼A258 (模体 2) 和 T444∼D448 (模体 3) (图 3b 和补充图 10)。为了确认模体 1−3 对 PaD 特异性的必要性，我们纯化了七种通过截短模体 1−3 修饰的蛋白，结果均对 4 无活性。我们还通过引入模体 1−3 合成了 7 种不同的 BTG13 修饰基因 (补充表 7 和图 45)。然而，只有含模体 1 的基因能够得到可溶性蛋白，但对 4 仍无活性 (补充表 7 和图 45)。

a PaD的晶体结构（PDB: 8Z4Q）。H63、H166、H317、H394、K397和一个水分子共同协调铁离子的结合。电子密度2Fo-Fc图显示了与铁结合的配体，采用灰色网格显示，并在2.5σ水平轮廓。 b PaD与BTG13的序列和结构比较。通过叠加BTG13和PaD的整体结构进行结构比较。三个独特的结构域（motifs 1-3）用黑框标出。由motifs 1-3决定的三个环状结构（loops 1-3）用金色标出。 c PaD结构中环1-3的位置，从不同角度观察。

为了确定PaD结构中motifs 1-3的氨基酸序列，我们获得了未结合配体的PaD的X射线晶体结构。PaD的结构由22个α螺旋（α1至α22）和4个310螺旋（η1-η4）组成（图3a）。与BTG13类似，PaD的活性位点由一个非常规的铁离子构成，该铁离子与四个保守的组氨酸残基（H63、H166、H317和H394）、一个不常见的羧基化赖氨酸（K397）以及一个水分子相互作用（图3a，补充图7和12）。先前对BTG13的密度泛函理论（DFT）计算表明，羧基化赖氨酸可以增强Fe(II)的电子供给能力，从而促进Fe(III)−O2•−物种的形成，这对随后的C-C键裂解至关重要【28】。

两种蛋白质的一级和高阶结构表现出显著的相似性，除了额外的三个环状结构，分别被称为环1、环2和环3，这些结构是由motifs 1-3决定的（图3b）。环1-3在活性口袋顶部汇聚（图3b）：环2明显向上延伸，而环1和环3朝着上方中心延伸，形成一个狭窄的底物通道，并显著增加了活性口袋的深度（图3b，c）。如图3c所示，Fe中心位于催化活性口袋的正下方。环1和环2在空间上彼此接近，口袋的开口显著收缩，可能阻碍较大底物的进入（图3c）。总之，环1-3形成了一个盖状结构，显著改变了上部子结构的三级结构。

关键氨基酸的作用

高分辨率的PaD-4复合物结构表明，1-OH基团和相邻的C-C键位于靠近Fe中心的位置，从而允许直接裂解（图4a和补充图13）。当底物与PaD结合时，水配体到Fe中心的距离从3.2 Å变为2.3 Å，R451的侧链旋转，导致胍基靠近4的羟基和甲氧基，并促进氢键的形成（补充图14a）。深入分析该复杂排列表明，环1主要包裹着底物（图4a，b）。环1上的F60通过π-π堆叠直接与底物相互作用（图4b）。将F60替换为A和W会显著降低活性，而用结构相似的芳香族氨基酸Y替换则保留了大约10%的活性（图4c和补充图8）。当将环1上的疏水性氨基酸V58和环2上的L253突变为丙氨酸时，活性完全丧失（图4b，c和补充图8）。然而，将L253替换为具有较大疏水基团的F或W，可以保留大部分活性（图4b，c和补充图8）。此外，环1上G57A和K56A的突变导致催化活性完全丧失，而环2上M251A的活性显著下降至20%（补充图8）。这些结果表明，环1和环2接口处的这些氨基酸可能通过疏水或范德华力维持底物通道和上部子结构的稳定性（补充图14b）。环3包括了各种极性氨基酸残基，如T444和H446。这些残基与邻近的氨基酸形成氢键，从而有助于口袋中的氢键网络。这种相互作用在稳定底物或Fe核心中起着至关重要的直接或间接作用（图4b）。T444和H446的突变也导致活性完全丧失（图4c和补充图8）。

a PaD-4复合物的整体结构（PDB: 8Z4R）。环1-3以金色标出。 b PaD-4复合物的活性位点视图。底物4在PaD中的电子密度2Fo-Fc图用灰色网格显示，并在1σ水平轮廓。 c 环1-3上PaD突变体的相对活性。9的产量被量化，定义野生型PaD的活性为100%。进行了三次生物平行实验（n=3），并以三角形点表示。误差线以标准差（SD）表示。ND: 未检测到。数据源文件作为源数据文件提供。 d PaD与BTG13的活性位点形状和底物结合模式的比较。BTG13复合物结构由Discovery Studio Client v19.1.0模拟。 e PaD的拟议催化机制。

PaD-4复合物与模拟的BTG13复合物结构的比较

模拟的BTG13复合物结构（补充图15）与PaD复合物结构（图4a，补充图13和14a）在底物结合模式上非常相似。预计在模拟的BTG13复合物中，氢醌4的三个氢键与H61和R451，以及H61与H193形成氢键（图4b）【11】。这些氢键对于将底物定位于适合C-C键裂解的正确位置至关重要【22】。此外，氢醌底物的末端羟基都指向Fe中心（图4d和补充图15）。

另一方面，PaD和BTG13的底物特异性存在根本差异（图1c）。与BTG13不同，BTG13具有一个没有任何屏障的宽敞口袋，底物可以与外界自由接触（图4d和补充图15），而PaD的环1-3作为盖子，牢牢包裹底物于活性口袋内（图4d）。虽然两种酶都能对氢醌进行二氧化作用，但值得注意的是，PaD的底物4在酚形式下明显更小（图1c和图4d）。先前的研究表明，BTG13的底物在蒽酮形式下更为稳定，与萘酚形式相比，能量差为3.4 kcal/mol【28】（图4d）。因此，在PaD复合物中，酚羟基指向Fe，而在模拟的BTG13-底物复合物中，是一个仲醇（图4d）。总的来说，PaD中的motifs 1-3的引入适应了底物大小和平衡形式的自然进化变化。

PaD的拟议机制

如图4e所示，4可以在反应缓冲液中互变为4a。从4a开始，Fe(III)−O2•−通过从sp3杂化碳上抽取氢生成（I），随后O-O键裂解形成中间体（II）。生成的Fe(IV)=O物种从（II）中抽取氢生成（III），然后通过氧自由基攻击形成环氧化物中间体（IV）。从（IV）开始，环氧化物的C-C键裂解以及质子耦合电子转移步骤，在H61的帮助下，生成内酯（VI）。（VI）通过Fe(II)-OH的羟基对内酯基团的亲核攻击转化为（VII）。最后，通过（VII）的C-O键裂解生成产物5。总之，这里提出的PaD机制类似于BTG13的最有利途径，该途径以从sp3杂化底物碳上抽氢并形成内酯中间体为特征。

包含motifs 1-3的PaD类蛋白质（PaDLs）对小型氢醌具有广泛的底物特异性

为了探究PaD的底物偏好，我们将PaD与各种氢醌S1−S13（补充图9a）孵育，这些氢醌是工业化学品，可能会造成环境污染。我们确实发现，PaD对甲基、甲氧基和三甲基氢醌具有芳香环裂解活性（图5a和补充图9b）。PaD的另一个显著特性是它能裂解氯化底物（图5a）。有趣的是，我们在S6的反应中观察到了与5类似的脱水产物，该产物显示出166的分子量，比拟议的二氧化产物少18个单位（补充图9c）。我们还将PaD与邻位和间位羟基取代的苯酚孵育，结果显示均无转化（补充图44），这证实了氢醌结构对PaD活性至关重要。

a PaD、MtaD、PaDL1和PaDL2的底物广谱性分析。PaDL1和PaDL2从PaD的同一簇中筛选。活性蛋白在测试的氢醌底物下方标出。 b 多色酸（multicolosic acid）的生物合成基因簇（BGC）及拟议的生物合成途径。 c PaDLs的序列相似性网络（SSN）分析。该SSN使用了从UniProt数据库中通过搜索含有Duf4243结构域的蛋白质得到的2730个PaDLs。

我们构建了一个包含10,239个真菌基因组的真菌蛋白质数据库（具体细节见方法部分）。通过在该数据库中进行基因组挖掘，鉴定出8701个PaD类似蛋白（PaDLs），分布于7303个真菌物种中，且至少与PaD有20%的序列相似性。为了探索其氢醌裂解的潜力，我们构建了所选2730个PaDLs的序列相似性网络（SSN）（图5c）。基于SSN，我们合成了位于PaD同一簇中的两个基因PaDL1和PaDL2（图5b），它们分别与PaD有62%和66%的序列相似性（补充图11）。序列分析表明，PaD与PaDL1和PaDL2共享与PaD相同的motifs 1-3（补充图10），这暗示它们可能也对小型氢醌具有双加氧酶活性。我们将PaDL1和PaDL2的基因转入E. coli BL21（DE3）细胞，并在标准表达条件下获得其蛋白质。我们评估了它们对底物4和S1−S13的活性。令人高兴的是，这两种酶至少对其中一种底物表现出了活性（图5a）。值得注意的是，PaDL2对S2和S11表现出显著的活性，能够完全转化这两种底物（补充图9b）。最后，除了PaDL1和PaDL2，我们还从SSN网络中获得了更多的PaDLs（PaDLs 3-5），这些结果已补充至补充图10。

系统发育分析揭示，PaD及其相关蛋白PaDL1和PaDL2形成了一个与已知的Duf4243加氧酶不同的独立分支（补充图11）。在确认PaD具有降解S6的能力后（补充图9），我们继续获得了PaD与S6结合的复合物结构。图6显示，S6在PaD口袋中的结合位点与PaD的天然底物4几乎相同（补充图16）。与PaD-4复合物相似，S6的末端1-羟基指向Fe中心，表明C-C键的裂解发生在C1和C2位置之间（图6）。S6与关键氨基酸F60、R451、H61等的空间距离分别为4.0 Å、3.0 Å和2.8 Å（图6b）。这些距离与这些氨基酸和天然底物4之间的距离相当（图6b和补充图16）。其他氨基酸如L253、V58、T444和H446的空间坐标也基本一致（图6）。总体而言，PaD-S6复合物结构有效地解释了PaD对单环氢醌底物的选择性催化活性。

a PaD-S6复合物的整体结构和底物结合位点视图（PDB: 8Z4S）。Loops 1-3以金色标出。PaD对S6的裂解位点及生成的产物显示在PaD-S6结构复合物的顶部，这一结构是基于结构和质谱分析提出的。结合在PaD中的氢醌S6的2Fo-Fc电子密度图以灰色网格显示，等高线设置为1σ。 b PaD-4和PaD-S6结构复合物中，结合氢醌与关键氨基酸的空间距离比较。

具有motifs 1-3的PaD同源蛋白MtaD参与了多色酸的生物合成

与青霉酸1类似，多色酸（图5b）也是通过氧化裂解来源于聚酮化合物的芳香中间体在自然界中生成的29。我们以PaD的蛋白序列为参考，成功地在P. sclerotiorum中发现了一个多色酸（11）的潜在生物合成基因簇（BGC）（图5b）。它编码7种蛋白质，包括一个细胞色素P450氧化还原酶（MtaA）、一个高还原PKS（MtaB）、一个硫酯酶（MtaC）、一个依赖黄素的单加氧酶（MtaE）、一个NR-PKS（MtaF）、一个GMC型氧化还原酶（MtaG）和一个含Duf4243结构域的蛋白质MtaD。MtaD与PaD有48.7%的序列相似性，并共享相同的motifs 1-3。尽管标记研究已经表明其生物合成涉及氢醌裂解29,30，但此前关于多色酸的BGC和生物合成机制尚不清楚。我们假设PaD的同源蛋白MtaD催化了这种裂解（图5b）。为验证这一假设，我们从E. coli中纯化了MtaD（补充图6），其对不同的单环氢醌显示了显著的底物广谱性（图5a和补充图9b）。最终，我们基于MtaD的功能提出了一个简明的11的生物合成途径（图5b和补充图43）。

讨论

据我们所知，成功改变底物选择性（从体积较大的三环结构到较小的单环结构）的蛋白质工程案例非常罕见。酶的底物特异性对底物的组成和比例有着显著影响，直接决定了最终产物的价值31。尽管随机突变和结构引导的进化在最近的酶重新设计中展示了其实用性32，但试图对酶的底物特异性进行微小改动仍然具有挑战性33。我们目前还缺乏预测结构变化对底物特异性影响的能力。为解决这一问题，有必要研究各种酶中底物特异性过程的分子和结构基础。

在本研究中，我们报道了A. westerdijkiae中PA的BGC以及其生物合成逻辑。在此过程中，我们鉴定出一种新型的Duf4243双加氧酶PaD，它催化了对单环氢醌的关键芳香裂解。我们系统分析了其与已知Duf4243双加氧酶在序列和结构上的差异，描述了由loops 1-3（motifs 1-3）组成的盖子状三级结构，形成了独特的活性口袋。loops 1-3上的关键氨基酸通过各种相互作用支持底物的进入、结合和活化。在motifs 1-3的指导下，我们鉴定出了更多的PaDLs，它们要么参与天然产物的生物合成，要么具有广泛降解小型氢醌化合物的能力。总体而言，我们的研究展示了自然界如何通过引入新motifs来支持底物特异性的显著转变，这可能为不同天然酶的定向进化提供了理论基础，而这里揭示的多功能PaDLs代表了一大类在自然界广泛分布的新型Fe(II)依赖的HQDOs。

方法

通用材料、菌株及培养条件

Aspergillus westerdijkiae NRRL 3174购自农业研究服务文化收藏（NRRL）。限制性内切酶和Q5 DNA聚合酶购自New England Biolabs（美国）。DNA测序和引物合成由擎科生物技术（北京，中国）完成。核磁共振（NMR）谱在Bruker AVANCE III 500仪器上记录（1H NMR为500 MHz，13C NMR为125 MHz）。纤维素酶和蜗牛酶分别购自Yakult（日本）和Solarbio（北京，中国）。高效液相色谱（HPLC）级甲醇和乙腈购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州）。其他分析试剂购自国药集团化学试剂北京有限公司。

PDA培养基（20 g葡萄糖，4 g马铃薯提取物，15 g琼脂，1 L水）用于A. westerdijkiae的孢子形成和发酵。YES培养基（20 g酵母提取物，150 g蔗糖，0.5 g硫酸镁·7H2O，20 g琼脂，1 L水）用于A. westerdijkiae的原生质体再生。大肠杆菌（E. coli）在LB培养基（10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g氯化钠，1 L水）中培养。感受态细胞大肠杆菌BL21（DE3）用于蛋白表达和纯化。

**从A. westerdijkiae中制备gDNA、RNA和cDNA**

为了提取A. westerdijkiae的基因组DNA和RNA，菌株在PDA培养基上于28°C培养3天，收集菌丝体。随后，将菌丝体冷冻于液氮中，并按照Omega真菌DNA提取试剂盒的说明提取基因组DNA。RNA提取使用Omega真菌RNA提取试剂盒按照制造商说明进行。cDNA通过EasyScript® One-Step gDNA去除和cDNA合成SuperMix（TransGen）中的随机引物从总RNA合成。

质粒构建

使用补充表1中的引物从A. westerdijkiae的基因组DNA中扩增目标基因（paB−E）。使用XhoI和NdeI限制酶线性化pET28a载体，然后通过Gibson组装法将目标DNA片段连接到载体上34。将连接产物转化到感受态大肠杆菌BL21（DE3）中。通过使用pET28a-paD质粒作为模板，使用TransGen Biotech的快速突变系统构建PaD的定点突变。筛选出正确的单克隆，用于进一步表达和纯化蛋白。PaD和PaE蛋白通过酿酒酵母蛋白表达系统获得。质粒pXW55（Ura标记）和pXW06（Trp标记）用于构建异源表达质粒。分别使用SpeI/PmlI和NdeI/PmeI限制酶消化pXW55和pXW06。通过Gibson组装法将线性化载体与目标DNA片段组装。本研究中用于扩增目标序列和构建质粒的所有引物列于补充表1和2。

**在A. westerdijkiae中构建基因敲除突变体**

从A. westerdijkiae基因组DNA中扩增目标基因的2k bp 5'-和3'-侧翼区域。通过融合目标基因的侧翼区域和潮霉素抗性基因，获得供体DNA片段，并将其整合到pUC57质粒中。使用10 mL的酶溶液（20 mg/mL纤维素酶和20 mg/mL蜗牛酶）制备原生质体35。然后通过聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化法将质粒转化到野生型A. westerdijkiae中，并在含有200 mg/mL潮霉素的YES培养基上进行原生质体再生。通过PCR使用补充表1中的测试引物对转化子进行鉴定，结果如补充图3所示。

蛋白表达和纯化

分别将pET28a-paB、pET28a-paC、pET28a-paD和pET28a-paE蛋白表达质粒转化到感受态大肠杆菌BL21（DE3）中。将相应的转化子在10 mL含35 μg/mL卡那霉素（kana）的LB液体培养基中37°C、220 rpm振荡培养过夜。将种子培养物转移到1 L LB培养基（35 μg/mL kana）中，在37°C和220 rpm培养至OD600达到0.4。加入0.1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在16°C诱导蛋白表达16小时。蛋白纯化通过Ni-NTA亲和层析（Solarbio，北京，中国）在4°C下按照标准协议36进行。通过离心（2600 × g，10分钟，4°C）收获细胞。将沉淀重悬于30 mL冷的结合缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，含有0.3 M NaCl和20 mM咪唑），并使用超声波处理器（SX-605D，恒隆仪器有限公司，常州，中国）破碎。通过离心（15,000 × g，1小时，4°C）去除细胞碎片。将上清液与Ni-NTA琼脂糖树脂混合，使用洗脱缓冲液（20 mM Tris–HCl，pH 8.0，含有0.3 M NaCl，40 mM咪唑和10%甘油）通过重力流柱洗脱。结合的蛋白使用含有0.25 M咪唑的洗脱缓冲液洗脱，并通过Amicon Ultra（Merck Millipore）在2600 × g下浓缩30分钟，4°C。蛋白浓度通过Bradford分析法，使用牛血清白蛋白（BSA）作为标准进行测定。纯化的蛋白储存在−20°C。

PaD中的Fe(II)含量测定

通过电感耦合等离子体-光学发射光谱法（ICP-OES, Optima 5300DV）测定PaD中的铁元素。纯化后的PaD蛋白用超纯水替换三次以测定铁含量，并对无PaD的样品进行类似处理作为对照。

PaB、PaC、PaD和PaDLs1-2的体外酶促反应

PaB催化反应在包含50 μM PaB、2 mM 2、50 μM FAD、4 mM NADPH、50 mM PBS（pH 7.0）的50 μL反应体系中进行。PaBC催化反应则在包含50 μM PaB、50 μM PaC、2 mM 2、50 μM FAD、2 mM SAM、4 mM NADPH、50 mM PBS（pH 7.0）的50 μL反应体系中进行。而PaD和PaDLs1-2的催化反应则在包含50 μM PaD、2 mM底物和50 mM PBS（pH 7.0）的50 μL反应体系中进行。所有反应均在25 °C进行，并用甲醇终止反应。通过离心（15000 × g，15分钟）去除蛋白沉淀，之后用LC-MS分析上清液。负对照则使用煮沸的蛋白（在沸水中孵育15分钟）作为反应成分，其他条件保持不变。

LC-MS分析是在AGILENT-1200HPLC/6520QTOFMS（美国）系统上使用C18分析柱（Gemini 150 × 2.0 mm，颗粒大小3 μm；Phenomenex）进行的。梯度条件如下：0 min，5% A；14 min，100% A；16 min，100% A；16.5 min，10% A；20 min，10% A。流速：0.3 mL/min。

化学互补与补料实验

对于用化合物（溶于DMSO）进行ΔpaA菌株的化学互补，ΔpaA孢子与0.2 mg的化合物2、4、8、9和10一起接种到PDA平板中，并在30 °C下培养3天。之后提取菌丝和培养基进行LC-MS分析。

为了测试paE基因在体内的功能，将paD和paE基因在酵母中表达，并在酵母中加入化合物4进行体内转化。携带pXW55-paE和pXW06-paD质粒的酵母最初在5 mL的缺陷培养基中培养过夜，之后将1 mL酵母细胞转移至10 mL的YPD液体培养基中继续培养16小时。随后收获细胞并将其重新悬浮在1 mL新鲜YPD培养基中，加入0.2 mg化合物3。24小时后提取培养物并进行LC-MS分析。

化合物1、2、4、7、8、9和10的纯化

化合物1、4、8和10从野生型菌株和突变体中分离。真菌在PDB培养基中培养，250 rpm下震荡培养37 °C，3天后提取培养物三次并用乙酸乙酯（EtOAc）获得粗提物。粗提物通过Sephadex-LH20柱层析（洗脱剂为MeOH: CH2Cl2 1:1）分离为子馏分，然后通过半制备HPLC纯化，得到化合物2（白色粉末，37 mg，来自2 L培养物）、4（白色粉末，53 mg，来自2 L培养物）、1（白色粉末，7 mg，来自0.5 L培养物）、8（红色粉末，44 mg，来自2 L培养物）和10（白色粉末，15 mg，来自2 L培养物）。为了分离化合物7，进行40 mL PaB与2的反应体系，在PBS缓冲液（pH 7.0）中反应1小时后用甲醇终止反应。溶液经旋转蒸发浓缩后，通过半制备HPLC进一步纯化，得到化合物7（红色粉末，5.4 mg）。类似地，化合物9（白色粉末，2 mg）从4 mL的PaD与4的反应溶液中分离出来。通过综合NMR光谱和MS谱图对这些化合物的结构进行鉴定，结果如补充信息中的Supplementary Figs. S17−42所示。

高效液相色谱（HPLC）分析使用Waters 2695（美国）系统，配有光电二极管阵列检测器和C18分析柱（Sepax GP-C18，250 × 4.6 mm，颗粒大小5 μm；Sepax Technologies）。流动相分别为含0.1%甲酸的乙腈（CH3CN）和水（H2O）。梯度条件如下：0 min，10% A；25 min，100% A；30 min，100% A；35 min，10% A；40 min，10% A。流速：1 mL/min。

PaDL相关基因的网络分析

通过将PaD蛋白序列比对NR（非冗余蛋白序列数据库）数据库，鉴定出共2730个PaDLs。使用在线酶相似性工具（EFI - Enzyme Similarity Tool）构建序列相似性网络（SSN）。网络构建的参数为比对得分阈值（Alignment Score Threshold）设为60，最小值为0，最大值为1100。SSN网络通过Cytoscape展示。

PaD的晶体化及结构测定

PaD的晶体通过悬滴蒸气扩散法培养。晶滴由1:1比例的蛋白溶液（20 mM Tris pH 7.0, 150 mM NaCl，浓度为15 mg/mL）与储液（0.1 M Tris pH 8.0, 25% PEG 1000, 0.1 M苹果酸钠pH 8.0）组成，平衡于储液上方。一周内长出大的菱形晶体（约100 μm）。为进行晶体冷冻保护，将母液替换为含有90% v/v储液（0.1 M Tris pH 8.0, 25% PEG 1000, 0.1 M苹果酸钠pH 8.0）和10%甘油的溶液。经过处理的晶体属于空间群P62，晶胞参数为ɑ = b = 120.209 Å，c = 93.305 Å，且每个晶体学不对称单位内有一个分子。X射线衍射数据集在台湾新竹国家同步辐射研究中心（NSRRC）的TPS 05 A光束线上收集，并使用HKL2000软件进行数据处理。PaD的晶体结构通过分子置换法（MR）利用AlphaFold预测的PaD结构作为搜索模型进行求解。随后使用Refmac538,39进行模型调整和精炼。为监测模型质量，随机选取了5%的反射数据用于计算Rfree。通过分子置换法使用Phaser和精炼的PaD结构作为搜索模型，确定了底物与S6的复合物结构。所有蛋白结构图均使用PyMOL软件（PyMOL）绘制。数据收集和精炼统计结果汇总于补充表6。