狼毒大戟中TPS新型二萜合酶的发现-文献精读99
Unexpected Main-Chain-Mediated and Neutral-Intermediate-Involved Catalytic Reaction in a High-Fidelity ent-Neoabietadiene Synthase
高保真度 ent-neoabietadiene合成酶中意外的主链介导和中性中间体参与的催化反应
摘要
半日花烷衍生型二萜成分（LRDs）是一大类萜类化合物。它们多样的骨架源于复杂的环化反应，这些反应由使用香叶烯基焦磷酸（GGPP）作为共同前体的LRD二萜合成酶（diTPSs）催化，并涉及多步的环化和重排。迄今为止，LRD diTPSs的催化机制仍基本未知。本文中，我们对来自狼毒大戟的五种LRD diTPSs进行了表征。特别是，EfTPS14是一种罕见的高保真度 ent-neoabietadiene合成酶，在抗癌LRD类化合物 jolkinoides 的生物合成中起着关键作用。其催化路径涉及一个中性中间体 ent-sandaracopimaradiene 和一个去质子化-再质子化序列，直接由位于G1/2断裂区的I644的羰基氧介导。此外，我们发现L765和L762负责区域选择性去质子化以生成 ent-neoabietadiene。这样一种主链介导的、中性中间体参与的路径丰富了我们对 diTPSs催化机制的理解，并为改变其催化特性奠定了基础。
引言
半日花烷衍生型二萜成分（LRDs）是最大的二萜类化合物群，约占迄今为止分离出的二萜类化合物的60%。（1）这一类化合物具有拉班烯型的双环骨架或其衍生的更复杂环系，包括三环结构（如 pimarane, abietane, cassane, and manoyl oxide)）和四环结构（如kaurane, atisane, beyerene, and stemodane）。（2）它们的结构多样性导致了多种生物活性，如抗癌、抗炎、抗寄生虫和抗病毒活性。（3）LRDs的生物合成通过关键中间体毛脂二磷酸（CPPs，包括nor-CPP、ent-CPP和syn-CPP）或其衍生物（如8α-羟基-CPP、8β-羟基-ent-CPP和佩雷吉醇二磷酸）进行（图1）。（2,4）这些中间体在相应的二类二萜合成酶（diTPSs）的催化下，从共同的二萜前体E,E,E-香叶烯基焦磷酸（GGPP）合成，如nor-CPP、ent-CPP和syn-CPP合成酶（2,4）（图1）。一类二TPSs，包括贝壳杉烯合成酶（KSs）和贝壳杉烯合成酶样二TPSs（KSLs），进一步将CPP转化为上述的三环和四环骨架，这些骨架也可以通过双功能的二TPS（如AgAS）直接从GGPP构建（图1）。（2,4）
图1. LRDs的一般合成路径。CPSs，毛脂二磷酸合成酶；CPP，毛脂二磷酸；KSs，贝壳杉烯合成酶；KSLs，贝壳杉烯合成酶样二TPSs。
TPSs的反应路径通常涉及令人困惑的重排和去质子化机制。（5）阐明催化机制及识别在重排和去质子化中起作用的关键氨基酸残基，可以通过酶工程重新塑造TPS的产物特征，以扩展萜类化合物的结构多样性或直接合成目标萜类化合物。（5）到目前为止，包括ent-CPP合成酶的二类LRD diTPSs（6,7），ent-copal-8-醇二磷酸合成酶和kolavenyl二磷酸合成酶（8），以及一类LRD diTPSs的ent-KSs（9−12）和nor-KSLs（13−15）已被广泛研究。此外，涉及环化级联反应的中间体和过渡态结构的固有反应性已通过气相中的量子化学计算进行研究。（16）然而，探索关键反应步骤的详细反应能量特征，以及氨基酸残基与中间体之间的相互作用，对于全面理解LRD diTPS机制和工程其催化特性是必要的。多尺度模拟，尤其是量子力学/分子力学（QM/MM）计算，为探索TPS的详细催化机制提供了强大的酶内计算方法。（17）
来自大戟科的狼毒大戟（Euphorbia fischeriana Steud.）富含LRDs，（18）并已从该植物中分离出超过180种LRDs。（19,20）在此，我们通过分析其转录组数据识别了五种LRD diTPSs。这些diTPSs分别被表征为ent-CPP合成酶、ent-neoabietadiene合成酶、ent-贝壳杉烯合成酶、ent-isopimara-7(8),15-烯合成酶和ent-atiserene合成酶。我们探讨了ent-neoabietadiene合成酶的催化机制，并识别了在从ent-sandaracopimaren-8-基阳离子形成neoabietadiene途径中负责质子转移和甲基迁移的关键氨基酸残基。这些发现将激励我们理性地工程化LRD diTPSs，以重塑其产物特征。
结果与讨论
LRD diTPS基因候选者的识别
为识别狼毒大戟中的LRD diTPS基因，我们从新鲜花朵、叶片、茎和根中提取RNA，并在Illumina Novaseq平台上进行测序。在组装和注释后，识别出总计50个长度超过1000 bp的TPS转录本。系统发育分析显示，这些TPS分布在所有含有被子植物TPS的亚科中，TPS-a亚科28个，TPS-b亚科11个，TPS-c亚科1个，TPS-e亚科4个，TPS-f亚科2个，TPS-g亚科4个（图2）。与LRD生物合成相关的二类和一类diTPSs分别属于TPS-c和TPS-e亚科。（21）EfTPS54是狼毒大戟中唯一位于TPS-c分支的TPS，并与来自丹参（Salvia miltiorrhiza）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）的ent-CPP合成酶关系更近（图2），表明它是一种ent-CPP合成酶。这与狼毒大戟中所有LRD均具有ent构型一致。（19,20）四种狼毒大戟 diTPSs（即EfTPS1、EfTPS14、EfTPS41和EfTPS43）位于TPS-e亚科（图2）。在EfTPS54和四种TPS-e亚科的diTPSs中，分别观察到了二类保守基序DxDD和一类保守基序DDxxD与NSE/DTE（图S1）。我们随后选择这五种diTPSs作为候选者，以表征它们的功能。
图2. 狼毒大戟中50个EfTPS的系统发育分析。该树由最大似然法构建。TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f和TPS-g亚科分别用绿色、粉色、橙色、黄色、紫色和蓝色标记。五个候选EfTPS以红色标出。参考TPS列表见表S1。
候选diTPSs的特征分析
ORF Finder分析显示，EfTPS1和EfTPS41具有完整的开放阅读框，而EfTPS14、EfTPS43和EfTPS54缺乏5′区域。通过RACE补充了这三个截短基因的全长序列。所有五个候选diTPS基因均从狼毒大戟的cDNA中克隆，并在细菌系统中进行功能表征，使用先前报道的包含上游异戊二烯生物合成途径关键基因的质粒，以及ERG20（酵母法尼基二磷酸合成酶基因），以增加前体GGPP的供给。（22）在单独表达这五个候选diTPSs后，只有EfTPS54产生了一个新的峰（m/z 290），其保留时间和MS碎片化模式与拟南芥的ent-CPP合成酶AtCPS（23）和从大行松（Abies grandis）衍生的nor-CPP生产突变体rAgAS（24）的产物相同（图3A），这表明EfTPS54可能是ent-CPP合成酶或nor-CPP合成酶。随后，我们共同表达EfTPS54和AtKS（拟南芥的ent-kaurene合成酶），后者仅接受ent-CPP作为底物（25），并观察到预期的产物ent-kaurene（4）（图3B）。因此，EfTPS54被确认是一种ent-CPP合成酶。
图3. E. coli中EfTPSs的功能特征分析。通过GC–MS检测分别表达CPP合成酶的E. coli菌株提取物（A）、EfTPS54/AtKS（B）、EfTPS14/AtCPS（C）、EfTPS1/AtCPS（D）、EfTPS41/AtCPS（E）和EfTPS43/AtCPS（F）。(G) 产物的结构。
接下来，我们分别与rAgAS（24）、AtCPS（23）和OsCPSsyn（26）（来自水稻的syn-CPP合成酶）共同表达EfTPS1、EfTPS14、EfTPS41和EfTPS43。所有四个diTPS仅与AtCPS展现活性（图3C–F），这表明它们都是底物特异性diTPSs。EfTPS14主要产生5，同时伴有微量的其他两种二萜6和7（图3C）。通过将它们的MS（质谱）谱与Agilent MSD通用库中收集的标准谱进行比较，确定5、6和7分别为ent-neoabietadiene、ent-沙达罗松烯和ent-阿比烯。通过对其NMR谱的分析进一步确认了5的结构。研究表明，挪威云杉（Picea abies）Levopimaradiene/Abietadiene合成酶（PaLAS）的初始产物是热不稳定的13-羟基-8(14)-阿比烯，该产物容易脱水生成levopimaradiene、abietadiene、neoabietadiene和palustradiene，符合GC–MS分析条件。（27）如果EfTPS14的产物是ent-13-羟基-8(14)-阿比烯（13-羟基-8(14)-阿比烯的对映体），GC-MS分析应显示与13-羟基-8(14)-阿比烯的脱水产物相同的ent-levopimaradiene、ent-abietadiene、ent-neoabietadiene和ent-palustradiene的比例。然而，EfTPS14主要产生ent-neoabietadiene，因此被认为是一种真实且罕见的特异性ent-neoabietadiene合成酶。Jolkinolide类二萜（如jolkinolide B）是狼毒大戟的重要药用成分，（28）它们在C-13和C-15之间具有烯烃键，并在C-8和C-14之间具有烯烃键、环氧或邻二醇功能（19,20）。这表明ent-neoabietadiene而非其他ent-阿比烯类烯烃（如ent-abietadiene、ent-levopimaradiene和ent-palustradiene）是jolkinolide类二萜的前体。（29）EfTPS1、EfTPS41和EfTPS43均产生单一产物（4、8和9），这些产物分别显示出与ent-kaurene、ent-isopimara-7(8),15-烯和ent-atiserene相同的MS谱（图3D–F）。通过与AtKS和IrKSL4（来自红色铁杆（Isodon rubescens）的ent-atiserene合成酶）所产生的产物进行保留时间和MS谱的比较，进一步确认了4和9的结构（图3D、F）。通过对相应菌株的大规模发酵获得了足够量的8以进行NMR数据的获取，结果与nor-isopimara-7(8),15-烯的NMR数据匹配，（31）进一步确认其为ent-isopimara-7(8),15-烯（即nor-isopimara-7(8),15-烯的对映体）。
EfTPS14的催化机制阐明
EfTPS14是一种罕见的高保真度ent-neoabietadiene合成酶，可能在抗癌jolkinolides的生物合成中发挥重要作用。因此，我们探索了其催化机制。如图4所示，ent-CPP由GGPP在ent-CPS的催化下环化生成，进一步环化为三环中间体ent-sandaracopimaren-8-基阳离子（IM1）。IM1随后转化为ent-abietenyl+（IM3），在IM3的不同位置发生去质子化，形成多种产物，其中ent-neoabietadiene是主要产物（93.4%）。值得注意的是，IM1向IM3的转化涉及重要的质子转移和甲基迁移，导致骨架从皮马烯型转变为阿比烯型，因此非常重要，值得详细研究。尽管同位素标记实验已追踪质子转移的过程，表明从CPP转化为abietadiene是由单一酶循环催化的，即在没有中间体从酶的活性位点释放和随后重新进入的情况下进行，（32−34）但仍存在争议：质子是否直接从C14转移到C16（末端碳），或是通过酶的活性口袋内的通用碱促进（图4）？对于后者机制，可能涉及初始去质子化，形成中性中间体，然后再质子化以完成质子转移。尽管这种涉及中性中间体的途径在一些单萜合成酶（如TEAS（35）和SdS（36））中被观察到，但在二萜合成酶中尚未报道。由于DFT计算预测的直接质子转移过程的能量障碍约为30 kcal/mol（在没有酶的情况下的气相模型），（37）因此推测酶可能通过非共价相互作用来稳定瞬态状态，以降低能量障碍。然而，去质子化-再质子化的确切反应机制仍待探讨。（37）
图4. EfTPS14酶催化的合理机制。pimarane型碳阳离子IM1通过ent-CPP的去磷酸化和初步环化形成。根据是否涉及通用碱和中性中间体ent-sandaracopimaradiene（IM2），IM1向abietane型碳阳离子IM3的转化有两条可能的途径。IM3的后续去质子化产生abietane型产物，其中5是通过IM3的C15去质子化生成的主要产物。
EfTPS14选择性地产生ent-neoabietadiene，同时也产生少量pimarane型副产物ent-sandaracopimaradiene（6，约3.4%，如图3C和S2所示）。这种中性中间体的存在支持了abietadiene骨架的形成在酶催化下在某种程度上通过顺序去质子化-再质子化级联反应进行。类似的顺序去质子化-再质子化催化过程在几个倍半萜合成酶中得到了观察。（35,36,38,39）因此，我们进行了量子力学/分子力学（QM/MM）计算，以阐明这一有趣的去质子化-再质子化级联反应机制（见下文）。
如图5A所示，EfTPS14的疏水活性位点主要由芳香族和非极性残基构成，并点缀少量极性残基。分子动力学模拟揭示了中间体IM1在酶口袋内展现出两种稳定的结合姿态（分别命名为“上姿态”和“下姿态”）（图S3和S4）。在上姿态中，碳阳离子C8和C-14的轴向氢（转移氢，以下简称Ha）靠近一个基本残基Thr538，而通常作为通用碱的焦磷酸根阴离子（PPi）则远离Ha（图S3）。因此，我们推测Thr538可能作为通用碱，从IM1的C14抽取Ha。为了验证这一可能性，我们进行了定点突变，将Thr538替换为疏水残基缬氨酸。然而，这种替代并未改变6的生成（图S2），这表明Thr538并不作为质子抽取的通用碱。随后将活性口袋中其他基本残基替换为疏水残基的实验也未影响6的生成（图S2）。在下姿态中，我们发现碳阳离子C14和Ha靠近两个G1/2断裂连接残基I644和G645的主链羰基（图5A和S4）。特别是在QM/MM分子动力学建模中，Ha与I644的羰基的距离仅约2 Å（图S5）。G1/2断裂区域在I类二萜合成酶中是保守的（5），但该区域的功能仍不清楚。受到我们之前关于倍半萜合成酶SdS研究的启发，该研究表明断裂区的甘氨酸182主链羰基介导了一个去质子化–再质子化过程，由甘氨酸182（羰基）-水-甘氨酸183（羰基）氢键网络辅助，其中甘氨酸182充当双重酸碱角色（36）。我们推测在EfTPS14中，去质子化也可能由作为通用碱的主链羰基介导。QM/MM计算表明，C14的质子转移至I644的羰基氧需要克服8.4 kcal/mol的能量障碍，导致轻微的吸热反应2.3 kcal/mol，并形成中性中间体IM2（6）（图5B、S6和S7）。QM/MM分子动力学模拟显示，IM2是一个亚稳态，质子在1 ps内迅速自发地从羰基转移至末端碳C16（图S8）。这种质子转移伴随着甲基迁移以形成IM3，是一个协同但不同步的过程（图S8）。进一步的QM/MM势能计算表明，这一协同过程需要克服1.4 kcal/mol的轻微能量障碍，并且放热24.4 kcal/mol（图5B和S9）。此外，在我们的计算中，ent-sandaracopimaren-15-yl+（IM2’）并不是之前研究中提出的稳定中间体（37），而是连接IM2和IM3的过渡结构（图S9和S10）。此外，还探讨了在没有通用碱参与的情况下质子（Ha）的直接转移，预测的障碍为25.1 kcal/mol（见图S11），在之前的计算研究中预测为约30 kcal/mol（37）。由于高能量障碍，该反应的可能性被排除。至于产生的IM3，尽管存在多个去质子化位点，QM/MM分子动力学模拟显示在限制的口袋中，只有C15的质子（Hb）与PPi保持接近，平均距离约为2 Å（图S12）。所有其他潜在的去质子化位点因与PPi的距离超过5 Å而被认为不可行（见图S12）。后续的QM/MM势能计算表明，Hb被PPi提取需要克服12.5 kcal/mol的能量障碍，伴随2.4 kcal/mol的热释放，最终生成主要产物5（图5B和S13）。
图5. QM/MM计算结果及位点定向突变验证。 (A) QM/MM捕获的活性位点结构及关键中间体/产物结合模式，G1/2断裂区域以青色突出显示。 (B) QM/MM预测的从IM1到主要产物5的潜在能量曲线。 (C) 在G1/2断裂区域关键氨基酸I644A的突变将主要产物从abietane型转变为pimarane型。
迄今为止，我们的QM/MM计算揭示了一系列催化步骤，与实验观察一致。计算提出的催化机制（图5）不仅很好地解释了EfTPS14为何能在abietadiene型产品中主要产生产物5，还揭示了主链羰基介导的质子转移过程，结合中性中间体6的参与，均在动力学和热力学上是可行的，从而解释了EfTPS14对6的微量产出。为了进一步验证这一合理的酶催化机制，进行了位点定向突变实验。
在大肠杆菌中，对与羰基相邻的残基（I644和G645）进行了饱和突变，如图S2所示。值得注意的是，位点645的所有替代导致酶失活，强调了其关键作用。此位点的小型、立体障碍的甘氨酸残基可能有助于断裂区域的形成。特别是I644A的替换引起了我们的关注，因为该酶保留了质子提取能力，但失去了质子转移功能，导致完全不产生abietadiene，同时显著提高了6的形成，增加了5–7倍（图S2和S14）。鉴于EfTPS14是一种植物来源的酶，该变异随后在烟草（Nicotiana benthamiana）中表达，结果显示：它仅产生6，且与野生型相比活性没有显著下降（图5C）。这一替换，特别是将非极性氨基酸从异亮氨酸更改为丙氨酸，区别于以往KSL研究中，极性与非极性氨基酸的改变可能通过阳离子-极性相互作用和碳正离子稳定性影响酶功能（9,14,40,41）。此外，相应的同源酶SiTPS8在断裂区域的残基（I449和A450）替换也展现出类似效果：产物中完全没有ent-abietane型烯烃（图S15和S16）。
接下来，进行了进一步的突变实验以探究口袋内其他氨基酸的功能（图S2）。大多数这些变体仅对酶活性产生负面影响（图S2），除了变体L765F和L762S显著改变了产物分布，以ent-abietadiene（7，来源于IM3的C7去质子化）作为主要产物（图S2和S14）。分子动力学结果表明，这可能源于口袋体积的增加（图S17和S18），使得碳正离子在口袋内具有更大的活动性，并使其他去质子化位点成为可能。此外，在这两个位点的组合突变导致变体酶EfTPS14L765F/L762S仅产生7（图S14A）。由于双键对反应性的影响，它们在萜烯骨架中的位置往往在很大程度上定义后续的氧化修饰。识别L765和L762在区域选择性去质子化中的作用，有助于理解在jolkinolides生物合成中的氧化选择性。
结论
我们从狼毒大戟中表征了一种ent-CPP合酶（EfTPS54）和四种仅接受ent-CPP作为底物的I类LRD二萜合酶。这很好地解释了从狼毒大戟中分离出的所有LRD均具有ent构型（19,20）。
在这些二萜合酶中，EfTPS14是一种罕见的特异性ent-neoabietadiene合酶。QM/MM计算显示其机制涉及主链介导的去质子化-再质子化序列，而不是C14到C16的直接质子转移，这在同位素实验中无法区分，因为在两种机制中，转移的质子最终都位于同一碳原子（C16）上（图4）。支持这一有趣级联反应的证据包括：（a）中性中间体ent-sandaracopimaradiene存在于EfTPS14的产物中；（b）活性口袋中所有碱性残基的替换不影响去质子化过程（即ent-sandaracopimaradiene的形成）；（c）主链介导机制的能垒显著低于直接质子转移过程；（d）详细计算表明，位于G1/2断裂区域的I644羰基发挥了双重作用——既作为通用碱抽取质子，又作为酸质子化中间体，I644的突变导致变体I644A保留了质子抽取功能，但失去了质子传递功能，即主要产物由neoabietadiene转变为sandaracopimaradiene（图5）。值得注意的是，这种主链介导的去质子化和再质子化可能在涉及中性中间体的二萜合酶级联反应中普遍采用，因为在SiTPS8（一种pimarane/abietane型烯烃TPS）中，对相应氨基酸（I449和A450）的突变完全阻断了abietane型烯烃的生产（图S16）。此外，我们发现L765和L762对于从C15进行区域选择性去质子化至关重要，尽管最终的碳正离子（IM3）具有多个去质子化位点的潜力。此外，双变体（L765F/L762S）使EfTPS14完全转变为ent-abietadiene合酶（图S14A）。因此，本研究扩展了对二萜合酶机制的认识，并促进了其在所需催化性质方面的工程改造。