来源于胡椒的亚甲二氧桥CYP450-文献精读119

Piper nigrum CYP719A37 Catalyzes the Decisive Methylenedioxy Bridge Formation in Piperine Biosynthesis

胡椒 (Piper nigrum) CYP719A37 催化胡椒碱生物合成中关键的亚甲二氧桥形成

摘要

胡椒 (Piper nigrum) 是世界上最受欢迎的香料之一。其主要辛辣成分胡椒碱 (piperine) 早在 200 年前就已被鉴定，但其在胡椒中的生物合成过程仍然 largely unknown。在本研究中，我们通过 RNA 测序、酵母中的功能性表达以及基于 LC-MS 的底物和产物分析，研究了胡椒碱芳香部分的特征性亚甲二氧桥形成。我们鉴定出一种特异性在胡椒未成熟果实中表达的细胞色素 P450 (CYP) 转录本，并在酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 中对其对应基因进行了功能性表达，测试了其对一系列芳香香草素结构前体的底物特异性。研究发现，该酶仅在以 feruperic acid（5-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2,4-戊二烯酸）作为底物时，才能催化亚甲二氧桥的形成，生成 piperic acid。相较之下，另一种潜在前体 ferulic acid 和 feruperine 均未被该酶催化接受。

我们的实验结果表明，胡椒碱的亚甲二氧桥形成发生在胡椒幼果阶段，其前体是 ferulic acid 经过推测的链延长后形成的，而该反应发生在酰胺键形成之前。我们对该部分表征的酶进行了分类，命名为 CYP719A37，并讨论了 CYP719 在木兰类植物和真双子叶植物中催化的特异性反应、存储特性及系统进化来源。

图 1. 胡椒碱的推测生物合成途径

胡椒碱 (piperine) 由芳香部分 piperoyl-CoA 和赖氨酸生物合成提供的哌啶杂环组成。本研究中描述的一种 CYP719 类酶 PnCYP719A37，催化 feruperic acid（5-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2,4-戊二烯酸）在其香草素特征结构上的亚甲二氧桥形成，生成 piperic acid。

胡椒碱分子中来源于苯丙素类的亚甲二氧桥结构是其生物合成过程中尚未完全解析的重要特征之一。理论上，该桥可以在 ferulic acid 或 feruperic acid 水平上引入，也可能在酰胺键形成后的 feruperine 阶段作为最终修饰被添加。基于转录组研究，我们结合胡椒不同器官的 RNA 测序数据和酵母中的功能性表达，鉴定并部分表征了一种特异性在果实中表达的细胞色素 P450 (PnCYP719A37)，该酶催化胡椒碱分子芳香部分的 3,4-亚甲二氧基团的形成。

2. 结果

2.1. PnCYP719 和 PnCPR 的鉴定与克隆

胡椒碱是胡椒果实中主要的特化代谢产物，其含量在果实成熟过程中迅速上升。在授粉后约 20 天时，其含量为 1 nmol/mg 鲜重，并在 40 天后增加至 10 nmol/mg（图 2）。在成熟果实中，胡椒碱含量进一步上升，在授粉后 100 天达到 100 nmol/mg 鲜重（图 S1）。相较之下，胡椒碱不会在叶片和花序中积累，而在成熟根部虽含量较低，但仍具有一定积累。

由于胡椒碱含量丰富，且胡椒果实中 piperoyl-CoA 连接酶的特异性转录水平较高 [27]，我们推测胡椒碱生物合成相关基因可能在果实发育的相似阶段共表达或至少高表达。此外，根据文献数据，胡椒碱的 3,4-亚甲二氧桥可能由 CYP719A 或 CYP81Q 类酶催化。因此，我们筛选了 IPB 研究机构生成的果实转录组数据，寻找在果实成熟早期被诱导的潜在 CYP 基因。在授粉后 20-30 天及 40-60 天的果实转录组中，我们在与一系列苯丙素代谢相关转录本共同表达的前 30 个最丰度序列中，仅鉴定出一个 CYP 序列。

图 2. 胡椒幼果中胡椒碱含量（授粉后 20 天和 40 天），与花序穗、叶片和根的对比。

胡椒碱及其相关酰胺类在花序穗和叶片中几乎完全缺失，而在根中也以较低水平存在。所有样品信号与 500 pmol 的胡椒碱标准品进行比较。胡椒碱含量通过 LC-MS 在 340 nm 波长及 m/z 286.1 [M+H]^+ 下监测。图中灰色区域标示了胡椒碱的峰值，并显示了其结构。

该唯一序列与 cheilanthifoline synthase 和 S-canadine synthase 表现出最高的相似性，二者皆属于 CYP719A 亚族 [13]。有趣的是，在该果实转录组中未鉴定出其他 P450 类型的转录本。此外，该转录本在未成熟果实中的表达水平（以百万转录本 TPM 表示）比在叶片或花序中的表达高出约十倍。研究者拼接出一个全长为 1500 bp 的转录本，编码一个 56 kDa 的蛋白，与植物 CYP719A 类型酶的预期序列长度和分子质量一致。

进一步地，研究者在果实转录组数据中也筛选了 NADPH 依赖型细胞色素 P450 还原酶（CPR）候选基因。结果同样仅鉴定出一个与拟南芥中还原酶 ATR1 和 ATR2（基因编号：At4g24520 和 At4g30210；http://www.tair.org）具有高度同源性的全长转录本。研究者使用授粉后两个月的果实提取总-8s8f5c14ulw0acnb75cyz7afmaw33fpozv06f3kua0yu.xn--5hqm53hb5i6hs41bi0h8ygwsao1xstb407foyd1vgpvk3sif2p/) RNA，合成 cDNA，并利用模块化 Golden-Gate 克隆系统 [29] 成功克隆了目标 PnCYP719 和 PnCPR 编码序列。

2.2. PnCYP719 在胡椒不同器官中的差异表达

为了验证 PnCYP719 的果实特异表达特性，并进一步印证 RNA 测序数据，研究者对胡椒不同器官（包括花序穗、果实（授粉后一个月和两个月）、嫩叶和根）中的 PnCYP719 表达情况进行了 RT-qPCR 分析。胡椒 elF2B 基因作为内参基因，其表达在各器官中相对稳定 [27]。

结果如图 3 所示：PnCYP719 在果实发育过程中表达最为显著，相较于叶片、花和根具有明显更高的表达水平。与胡椒碱在根中一定程度的积累一致，该基因在根中也可检测到一定表达水平，而在叶片和花中则几乎检测不到。

至于对应的还原酶基因 PnCPR，在各组织中也呈现出类似的趋势，但差异相对较弱。

这些结果支持了研究假设，即胡椒碱生物合成相关基因（如 piperoyl-CoA 连接酶和 PnCYP719）在果实发育期间优先生表达，可能共同参与胡椒碱的形成。

图 3. 胡椒 (*P. nigrum*) 中 *CYP719A37* (a) 和 *PnCPR* (b) 基因在不同器官中的相对转录水平，使用 *elF2B* (*TR23978*) 作为参考基因 [27]。

每个箱形图代表九个数据点，由三组生物重复，每组包含三个技术重复组成。各编号代表的器官如下：1. 花序穗；2. 果实（20–30 天）；3. 果实（40–60 天）；4. 幼叶；5. 根。

2.3. 异源表达的 *PnCYP719* 具有底物特异性

对酶活性的功能性解析需要确定其底物特异性。内质网定位的植物来源 CYP 序列已成功通过酵母表达获得活性 [30,31,32]。本研究采用模块化 Golden Gate 克隆系统，同时表达来自拟南芥和胡椒的两种还原酶 (ATR1 和 PnCPR)，并与 PnCYP719 共同表达。在酵母细胞中分离微粒体后，对产物的形成进行监测。此外，研究者还直接向培养的完整酵母细胞提供底物进行实验。

底物的选择仅基于其芳香香草酰基 (vanilloid) 结构，并根据脂肪碳链的长度分类为 C6-C5（feruperic acid 和 feruperine）、C6-C3（coniferyl alcohol、coniferyl aldehyde 和 ferulic acid）或 C6-C1（vanillin 和 vanillic acid）结构。

其中，具有较长脂肪链的 feruperic acid 和 feruperine 被认为是最可能的前体，但商业上不可得。研究者通过 feruperic acid 的化学合成方法 [27] 合成了酰胺类 feruperine，并通过 1H NMR、13C NMR 和质谱分析确认了其结构。

反应产物的检测基于紫外吸收特征，并关注因产物的亚甲二氧基 (methylenedioxy) 结构损失两个氢原子导致的预期质量缺失。所有测试底物中，仅 feruperic acid 可被转化为 piperic acid，其结构中含有目标亚甲二氧基。

该反应在从酵母中提取的微粒体中以蛋白量依赖的方式高效进行（图 4）。随着总蛋白量从 50 µg 增加至 250 µg，产物的生成呈稳定增长趋势。所得产物的保留时间、质谱信号 (m/z 219.1 [M+H]+) 以及最大吸收波长 (344 nm) 均与商购 piperic acid 标准品一致。无论使用 PnCPR 还是 ATR1 作为还原酶，实验结果均相同（图 4）。

然而，在野生型或载体对照酵母的微粒体中，均未检测到任何反应信号。当直接向转基因酵母细胞发酵体系中添加 feruperic acid 时，尽管在上清液中仍可检测到 piperic acid，但其信号强度低于微粒体实验。

在所有其他情况下，包括 feruperine 作为底物时，均未检测到 piperic acid 或任何亚甲二氧基产物（表 1）。值得注意的是，即使将 feruperine 底物的孵育时间延长至 24 小时，也未检测到产物信号（即 piperine）。尽管该化合物此前曾在胡椒及其他 Piper 物种中分离得到（图 S2，[33]）。此外，ferulic acid 作为底物时，也未检测到产物 (3,4-methylenedioxycinnamic acid)（图 S3）。

图 4. 高效液相色谱-紫外-质谱 (HPLC-UV-MS) 分析 *PnCYP719* 和 *PnCPR* 转化酵母微粒体馏分在 *feruperic acid* 孵育 2 小时后的产物。

色谱图显示了不同浓度的微粒体提取物催化产生 piperic acid 的情况：(b) 50 µg；(c) 100 µg；(d) 250 µg 总蛋白（与 PnCPR 共表达）；以及(e) 250 µg 总蛋白（与 ATR1 共表达）。此外，还提供了空载体对照 (a) 以及 10 pmol piperic acid 作为参考产物 (f) 的色谱图。

记录了 piperic acid 在 344 nm 处的紫外吸收信号，以及其对应的单一质荷比 (m/z 219.1, [M+H]+) 质谱信号。用箭头标出了目标产物 piperic acid，其化学结构示意图展示于右侧。

表 1. 在 *PnCYP719* 微粒体酶促实验（最长孵育 24 小时）中测试的带有 *vanilloid* 结构特征的芳香族底物列表及其相应的底物和产物的质荷比 (*m/z*) 值。

1 No standard available, identification would be based on expected mass signals. 2 n.d. not detected.

当其他 vanilloid 结构的 C6-C3 或 C6-C1 底物被提供给酵母时，并未观察到亚甲二氧基 (methylenedioxy bridge) 形成的相应信号。相反，在长达 24 小时的孵育后，在酵母中检测到了几种解毒产物。例如，coniferyl alcohol 被转化为 vanillic acid (m/z 171.1 [M+H]+) 和 ferulic acid (m/z 195.1 [M+H]+)；coniferyl aldehyde 也被转化为 ferulic acid；而 vanillyl alcohol 和 vanillyl aldehyde 被氧化为 vanillic acid。类似的观察结果此前已有报道 [34]。

总的来说，这些数据进一步证实了 PnCYP719 对 feruperic acid 具有高度专一的底物特异性。我们的数据支持这样一个假设：胡椒果实中的胡椒碱 (piperine) 是通过一系列酶促反应合成的，首先由 ferulic acid 进行碳链延长，形成 C6-C5 前体 feruperic acid，随后被转化为 piperic acid，再经 piperoyl-CoA ligase 激活，最终由 piperine synthase 催化生成胡椒碱 [26,27]。

2.4. *PnCYP719* 和 *PnCPR* 的系统发育及结构特征

在所有分析的器官转录组中，PnCYP719 是唯一一个完整的 cDNA 序列，与可能形成亚甲二氧基桥的酶编码基因具有相似性。该酶在氨基酸水平上与近年来鉴定出的 Piper methysticum 根茎来源的 CYP719A26 具有 95% 的同源性，后者能够在 kavalactones 分子上引入亚甲二氧基 [19]。然而，两者在底物特异性和组织特异性方面明显不同。

因此，尽管 PnCYP719 很可能是 CYP719A26 的直系同源物 (orthologue)，但仍被归类为 CYP719A37（Cytochrome P450 Homepage – Another UTHSC WordPress site）[35]。其与 kava 植物 CYP719A26 之间的相似性在系统进化树中得到了体现，该进化树包含 CYP719、CYP81 和 CYP77 族的多个代表，这些族都属于更广泛的 CYP71 族群（图 5）。

两个 Piper 物种的 CYP 序列与已鉴定的 CYP719A 和 CYP719B 类酶约 50% 相似，这些酶主要来源于产生苄基异喹啉生物碱 (benzylisoquinoline alkaloids) 的毛茛科 (Ranunculaceae) 和罂粟科 (Papaveraceae) 植物，例如：C. japonica (四氢小檗碱合酶, tetrahydroberberine synthase)、P. somniferum 和 A. mexicana (喜树碱合酶, cheilanthifoline synthase；加拿大啶合酶, canadine synthase；stylopine synthase)，以及 A. mexicana (salutaridine synthase, CYP719B1)。目前，CYP719B1 是该亚群中唯一已鉴定的 C-C-苯酚偶联酶 (C-C-phenol-coupling enzyme) [8]，类似反应也由 CYP80 族成员催化 [36]。

此外，CYP719A26 和 CYP719A37 还与一些早期分化的被子植物 (early diverging angiosperms) 中的 CYP719 类序列聚类。它们与樟科 (Lauraceae) 植物 Cinnamomum kanehirae（大叶樟）的 CYP719 类序列具有高达 55% 的序列同源性（已列出其中 6 个序列中的 2 个）。此外，莲属植物 Nelumbo nucifera（圣莲）中的一个 CYP719 类似序列也位于最接近的直系同源基因列表中。

在 CYP719 族群之外，序列相似性最高的基因是来源于拟南芥 (Arabidopsis) 的 CYP77A4，该酶催化脂肪酸环氧化反应 [31]。相比之下，CYP81 族成员虽然在理论上可以催化相同类型的反应，但在系统发生上与 CYP719 族群明显不同。

结构上，CYP719A37 具有典型的真核生物特征，包括 K-螺旋 (K-helix)、芳香族结合域 (aromatic-binding domain)、位于 C 端的血红素结合域 (heme-binding domain)，以及位于 N 端的疏水膜锚 (hydrophobic membrane anchor)，表明其可能定位于内质网 (ER)。此外，该酶还具有 CYP719A 族特有的 G300L 和 T304S 取代突变，这些突变可用于区分 CYP719A 和 CYP77 族（图 S4）。

图 5. 胡椒 CYP719A37 蛋白序列的自举无根系统发育树，涵盖 25 种选定的 CYP 序列，这些序列涉及亚甲二氧基桥的形成 (CYP719A, CYP81Q)、酚类偶联 (CYP719B, CYP80G2) 或环氧化反应 (CYP77)。绿框标出了胡椒科 (Piperaceae) 酶的亚支系。该系统发育树采用 Clustal V 算法构建。登录号详见附录 A。

在胡椒果实转录组中并行鉴定出的还原酶 PnCPR，其氨基酸序列与氧化还原酶显示出预期的相似性，其中与拟南芥 (Arabidopsis) 的 ATR1 和 ATR2 的相似性分别为 63% 和 68%。PnCPR 具备典型的 CPR (细胞色素 P450 还原酶) 结构特征，包括 FMN-PPi、FMN-异阿洛嗪 (isoallozazine)、底物、FAD-PPi 和 NADPH-核糖结合域。

3. 讨论

细胞色素 P450 (CYP) 催化多种酶促反应，并在整个植物界的特化代谢途径多样化过程中发挥重要作用 [3]。尽管胡椒碱 (piperine) 早在 200 年前便已被发现，并且其最早的生物合成实验可追溯到几十年前，但 piper酰胺类化合物的合成途径仍未完全解析。本研究通过结合生物信息学、合成生物学和分子生物学工具，揭示了这一谜题的重要部分。我们的实验数据验证了先前的假设，即胡椒碱的亚甲二氧基桥是在香豆酸 (feruperic acid) 经过 C2 延长后形成的。该生物合成途径可能涉及以下酶促级联反应：首先氧化香草酸 (feruperic acid) 的香草酰结构，随后胡椒酸 (piperic acid) 由胡椒酰-CoA 合成酶 (piperoyl-CoA ligase) 激活 [27]，最终在胡椒碱合酶 (piperine synthase) 催化下形成胡椒碱 [26]。

CYP719A37 的鉴定基于其在成熟绿果中的高丰度表达，以及其与毛茛科 (Ranunculaceae) 和罂粟科 (Papaveraceae) 苯基异喹啉生物合成中催化亚甲二氧基桥形成的酶的明显相似性 [7,13,37]。在先前的研究中，通过 CYP 相关基因共表达分析成功解析了多种特化代谢途径，例如孢粉素 (sporopollenin) 生物合成 [38]。CYP719A37 和胡椒酰-CoA 合成酶 [27] 似乎与一系列其他潜在的代谢途径基因共表达，我们正在对这些基因进行进一步分析，包括与香豆酸 C2 延长相关的候选基因以及可能编码胡椒碱合酶的酰基转移酶。此外，结合近期对胡椒基因组的注释 [39] 及其差异转录组数据，胡椒碱生物合成路径的剩余步骤有望在不久的将来得到解析 [40]。

酵母微粒体是异源表达 CYP719 类酶的可靠来源，且具备较高的催化活性 [7,41]。CYP719 家族包含多种催化底物专一性和位点选择性极高的生物碱生物合成酶 [6,7,13,14]。与先前的假设一致，CYP719A37 似乎具有独特的底物偏好，至少需要五个碳的脂肪链长度。此外，胡椒果实中的少量胡椒酰胺，如 piperettine (C6-C7)，可能也可作为该酶的氧化底物。而胡椒科 Piper guineense 种子中检测到的 C13-长链胡椒酰胺 (如 guineensine) 可能需要具有不同底物选择性的 CYP719A37 直系同源酶。未来对这些来自胡椒科不同物种的直系同源酶的功能表达研究，有望揭示决定碳链长度特异性的关键氨基酸残基。

与尼古丁 (nicotine) 或吡咯里西啶类生物碱 (pyrrolizidine alkaloids) 主要在根部合成不同，我们推测胡椒碱的生物合成主要发生在果实中。这一推测基于果实中高含量的胡椒碱及其生物合成酶，包括关键的胡椒碱合酶 [40]。然而，CYP719A37 在根部的低水平表达及胡椒碱的存在，表明该化合物可能在根部发挥防御作用。

胡椒果实中极高的胡椒碱含量需要特定的通道化机制、分区存储，以及专门的细胞结构用于储存和沉积。近年来的研究已探讨了不同大小和来源的潜在储存区室，包括分化的质体、液泡或内质网 (ER) 派生的微区室，以及大型腺体区室，以解释不溶或不稳定代谢物高达摩尔浓度的储存机制 [45]。天然深共熔溶剂 (NADES) 由不同糖类、有机酸、胆碱或甜菜碱混合组成，可增强活性代谢物的稳定性和溶解度，同时维持生物合成酶的活性和组织化，如近期在高粱氰苷 (dhurrin) 和大麻素生物合成中的研究所示 [46,47,48]。研究影响胡椒酸等代谢中间体通道化及胡椒碱储存的相关机制，将是未来的一个重要研究方向。

CYP719 酶属于 CYP71 大家族，该家族被认为是被子植物的一个重要创新 [3]。然而，CYP719 基因及其催化的亚甲二氧基桥在被子植物早期分化支系 (ANA 进化支，包括木兰藤目、睡莲目和五列木目) 中似乎缺失。被认为是所有现存被子植物的姐妹群的植物，如单种属植物阿姆博雷拉 (Amborella trichopoda) 和近期测序的睡莲 (Nymphaea cordata)，既没有 CYP719 相关基因，也不含苯基异喹啉生物碱或亚甲二氧基桥结构的木脂素 [49,50,51,52]。这表明 CYP719 类基因是在 ANA 进化支与木兰类植物和真双子叶植物分化后才发展出的。与我们的转录组数据一致，最新的胡椒基因组数据及莲花基因组注释均显示，这两个木兰类物种中仅含有一个 CYP719 基因 [39,53]，而厚朴属 (Lauraceae) 的 stout camphor 物种中则包含多个 CYP719 基因 [54]。在毛茛科和罂粟科中，CYP719 基因发生了多次复制事件 [6,7,14,15,55]。

胡椒 (P. nigrum) 和卡瓦胡椒 (P. methysticum) 的 CYP719A26 和 CYP719A37 基因可能来源于共同祖先。卡瓦胡椒被认为是波利尼西亚群岛特有的 Piper wichmannii 的无性繁殖栽培种，与胡椒在地理上完全隔离 [56]。尽管 P450 同源酶往往催化不同的反应，如 F209L 突变可将香豆素 7-羟化酶转变为睾酮 15α-羟化酶 [57]，未来对卡瓦胡椒酶的克隆和功能研究将揭示其是否可催化胡椒碱前体的转化。

通过对胡椒目 (Piperales) 4000 多个物种进行序列、转录组和基因组数据挖掘，有望揭示 CYP719 亚支系的结构-功能关系，阐明个别化合物的体内功能，并促进新型生物催化剂的开发，助力生物技术和药物应用 [61,62]。

4. 材料与方法

4.1. 植物材料、RNA提取及cDNA合成

胡椒植物的插条取自维也纳大学植物园（奥地利），这些植物采集于1992年，IPN编号LK-0-WU-0014181，并在温度和湿度受控的温室条件下生长，具体条件参见文献[27]。转录组数据来源于胡椒果实、叶片及开花肉穗花序，并已提交至ArrayExpress数据库（BioStudies < The European Bioinformatics Institute < EMBL-EBI）。 在RT-qPCR分析中，不同发育阶段的果实、开花肉穗花序、幼叶及根系RNA被收集，并在液氮中直接使用球磨机（Retsch，德国）研磨。RNA按照生产商说明使用Nucleospin® RNA Plus Kit（Machery-Nagel, Düren, 德国）提取，并使用Maxima H Minus First Strand cDNA Synthese Kit（Thermo Fisher Scientific, Dreieich, 德国）进行逆转录。

4.2. 芹酸和芹啶的化学合成

所有化学试剂，包括具有香草素结构的底物，均购自Merck（Sigma, Darmstadt, 德国）。芹酸的化学合成（图1）已在近期文献[27]中详细描述。替代底物芹啶的合成按照文献[23]的方法进行。简要来说，100 mg的芹酸（100 mg）与DIC（N,N′-二异丙基碳二亚胺）（76 µL）和HOBt（羟基苯并三唑一水合物）（73.4 mg）在干燥的二氯甲烷（25 mL）中混合，室温反应10分钟后加入哌啶（46 µL）。反应混合物搅拌至起始物完全消耗（TLC: 二氯甲烷/乙酸乙酯=3:2）。反应粗产物在硅胶柱上纯化（流动相：二氯甲烷/乙酸乙酯=3:2）。最终产物：75 mg，产率57%。

4.3. 胡椒甲醇提取物的制备

胡椒的果实、肉穗花序、叶片及根系均从温室培养的植株中获取，并制备甲醇提取物。组织材料被冷冻后，在球磨机（Retsch）中研磨，以100 mg/mL浓度溶解于90%甲醇中，超声处理5分钟后，以20,000 g离心2分钟。根和果实的提取物被稀释至10 mg/mL。所有样品使用Waters Alliance高效液相色谱（HPLC）系统分析，该系统配备紫外检测器及QDA质谱检测器，并使用Empower III软件进行数据处理。采用水（0.1%甲酸，v/v）（溶剂A）和乙腈（溶剂B）的梯度洗脱方法，在10分钟内溶剂B的比例从30%升至90%，流速为0.8 mL/min。样品分析时，每次进样体积为5 µL或10 µL，并与100 pmol/µL的胡椒碱标准进行比较。

4.4. PnCYP719A和PnCPR基因的克隆

通过筛选胡椒的转录组数据，鉴定出在胡椒果实中特异性高表达的CYP和CPR同源基因。最终选定全长候选基因PnCYP719A37和PnCPR，使用基因特异性引物（Eurofins Genomics, 德国；表1）进行扩增，并按照Golden-Gate克隆法进行克隆，以便在酵母中表达[29,63,64]。基因片段在扩增过程中通过无声突变去除了BsaI/BpiI限制性位点（装配水平-1），随后插入入门载体（装配水平0）。质粒使用Nucleospin®试剂盒（Machery-Nagel）纯化，并由Eurofins Genomics测序。最终，CYP719A37的扩增子与合成的半乳糖诱导启动子Gal6及tPGK-1终止子进行组合（装配水平1）。在装配水平M，CYP719A37扩增子分别与PnCPR或ATR1还原酶进行组合。Gal6启动子及用于酵母表达的ATR1片段由Leibniz植物生物化学研究所（IPB, 德国）的Alain Tissier和Ulschan Bathe提供[32]。克隆载体包含大肠杆菌（ColE1）和酵母（2 µm ori）的复制起点。抗生素选择标记分别为卡那霉素（-1级）、氨苄青霉素（1级）及壮观霉素（0级及M级）。酵母阳性克隆的筛选标记为URA3基因，该基因编码乳清酸5-磷酸脱羧酶。PnCYP719A37及PnCPR的GenBank登录号分别为MT643912和MT643913。

4.5. S. cerevisiae INVSc1中的瞬时基因表达

构建的表达质粒PnCPR:CYP719A37和ATR1:CYP719A37随后按照标准协议转化至酿酒酵母（S. cerevisiae）INVSc1（Thermo Fisher Scientific）。阳性克隆于5 mL不含尿嘧啶（Ura3）的培养基（含2%葡萄糖）中培养，30°C、170 rpm振荡过夜。此预培养液用于接种200 mL Ura3培养基（2%葡萄糖），培养条件相同，持续24 h。细胞收集后以离心（4000× g, 10 min）回收，重悬于酵母提取-蛋白胨培养基（含2%半乳糖），在相同条件下培养过夜，用于瞬时酵母细胞实验或微粒体分离。

4.6. 瞬时酵母细胞实验中酶活性的表征

表达后，酵母细胞被离心收集，并调整至最终OD600=50，以50 mM HEPES缓冲液（pH 7.5）重悬。酶活测定中，95 µL酵母细胞悬液与5 µL 5 mM底物于30°C、1000 rpm振荡孵育过夜。细胞离心（25,000× g, 20 min），取上清，并以1:1体积比例与100 µL混合溶剂（4份甲醇，1份20%甲酸）混合。细胞再次以相同条件孵育过夜，以提取产物。初始上清及甲醇细胞提取液均通过LC-MS检测产物形成。

4.7. 微粒体CYP体外酶活性测定

微粒体提取方法参考文献[32]，简要而言，酵母细胞在含山梨醇及BSA的缓冲液中与玻璃珠研磨，100,000 g离心2小时后获得微粒体，并重悬于50 mM Tris/HCl（pH 7.5）、1 mM EDTA、30%甘油溶液中。蛋白浓度通过Bradford蛋白测定法（Bio-Rad, Feldkirchen, 德国）测定，微粒体存储于-80°C。所有实验均设三次重复。单次实验中，反应体系包含50–250 µg微粒体蛋白、250 µM底物、1 mM NADPH及50 mM HEPES缓冲液（pH 7.5），最终体积600 µL，30°C、90 rpm孵育2–24 h。反应通过加入20 µL 20%甲酸终止，并在冰上放置10 min。离心（25,000× g, 15 min）去除蛋白后，乙酸乙酯萃取，浓缩至100 µL 100%甲醇，并通过LC-MS检测产物形成。

4.8. PnCYPA37 和 PnCPR 转录本的 RT-qPCR 分析

CYP719A37 和 PnCPR 编码转录本的表达模式通过 RT-qPCR 进行分析，使用来自果实（授粉后一个月和两个月）、开花花序、幼叶和根的 cDNA。cDNA 合成使用 200 ng RNA 进行。RT-qPCR 采用 qPCR Mix EvaGreen® No Rox（Bio&Sell，德国 Feucht）试剂，反应体系为 10 µL，包括 3 µL 1:10 稀释的 cDNA 和 2 pmol 每种引物（表 1）。反应通过 CFX Connect™ 实时荧光定量 PCR 系统（Bio-Rad，德国慕尼黑）进行记录。胡椒 elF2B 基因作为参考基因 [27]。每种组织进行了三个技术重复和三个独立的生物学重复实验。

4.9. 数据可用性与存储

图 5 中基因的 NCBI 登录号和基因标识符列于表 S1。RNA-Seq 数据存储在 ArrayExpress，并可通过以下链接访问： BioStudies < The European Bioinformatics Institute < EMBL-EBI。

5. 结论

总而言之，我们鉴定了一种催化胡椒碱生物合成中关键亚甲二氧桥形成的酶，该酶在 CoA-连接酶激活之前起作用。这一发现通过实验验证了一个假设的合成途径，即 piperine synthase 活性将苯丙素代谢途径与氨基酸代谢相连接，最终形成一种辛辣生物碱，并构成了自古以来最著名香料——胡椒碱的分子结构。