以更高分辨率和体内方式了解 lncRNA 的生物发生和功能

文献题目《Towards higher-resolution and in vivo understanding of lncRNA biogenesis and function》，作者：陈玲玲 CLL

接下来我讲逐段对文献进行翻译，并附上每段的解读/解释

最近的研究揭示了长非编码RNA（lncRNAs）在基因调控中的多方面作用，同时伴随着对lncRNA的加工、定位、相互作用的生物大分子以及结构模块的理解不断加深。本文重点介绍了在理解lncRNA的发生、作用模式以及细胞表型方面取得的进展和新近发展的技术，并讨论了在该领域实现更高分辨率和体内研究的挑战和机遇。

解释：

这段文字主要讨论了lncRNAs（长非编码RNA）在基因调控中的多种功能。lncRNAs是一类不编码蛋白质的RNA分子，近年来研究表明它们在调控基因表达中扮演了重要角色。文中提到了四个方面的进展：

1. lncRNA的加工：指的是lncRNA的生成过程，包括转录、剪接和成熟等步骤。
2. lncRNA的定位：即lncRNA在细胞中的分布情况，可能在细胞核、细胞质甚至特定的细胞器中。
3. 与大分子的相互作用：lncRNAs常常通过与蛋白质、DNA或其他RNA分子相互作用来行使其功能。
4. 结构模块：lncRNA分子有特定的结构区域或功能域，这些模块对于其与其他分子的相互作用以及行使调控功能至关重要。

此外，文章提到对lncRNA的研究已经得到了技术上的提升，包括在生物发生过程中的作用机制研究以及lncRNA与细胞表型（细胞的特征和行为）之间的关系。最后，文中还指出了当前研究中的挑战和机会，尤其是在高分辨率研究和体内（in vivo）研究方面。

在过去的十年里，RNA测序（RNA-seq）的出现揭示了哺乳动物基因组中普遍的转录现象，已经发现了超过10,000种长非编码RNA（lncRNAs）。这些lncRNA的长度从200核苷酸(nt)到大于100,000核苷酸(knt)不等，通常在特定的细胞类型和组织中以低序列保守性表达，并且通常不与明显的表型相关。得益于技术进步，过去十年的研究突显了lncRNA在时空表达、亚细胞加工和定位模式上的意想不到的复杂性，以及它们在多个细胞层次上多样的作用模式，具体表现在调控染色质功能、调节核体的组装与功能、改变细胞质mRNA的稳定性和翻译以及干扰信号通路1。然而，lncRNA的生命周期和作用机制的完整注释仍远未完成。这包括对以下问题的理解：某个特定的lncRNA‘何时’被转录，‘是什么’，‘在哪里’定位，‘如何’发挥作用，以及最终‘它做了什么’（图1a）。我预见到，最近在测序和成像工具、体内动物和类器官模型、质谱技术以及结构生物学中的计算建模等方面的技术进展，将加速对特定lncRNA在基因调控中的独特途径、分子机制和表型的理解。

解释：

这一段描述了长非编码RNA（lncRNA）研究领域的重大进展，尤其是RNA测序（RNA-seq）技术推动了对哺乳动物基因组中广泛转录现象的发现。这段文字的核心要点包括：

1. lncRNA的数量和长度：研究发现了超过10,000种不同的lncRNA，它们的长度变化较大，从短至200核苷酸(nt)，长至超过100,000核苷酸(knt)。

2. 特异性表达：lncRNA通常在特定的细胞类型或组织中表达，而且序列保守性较低，即它们的序列在不同物种之间的相似性较小。此外，这些lncRNA通常不直接与明显的表型（例如某种可见的性状或疾病）相关联。

3. 功能复杂性：尽管早期认为lncRNA功能简单，近年来的研究揭示了它们在时空表达和亚细胞层次的复杂性。lncRNA不仅调控染色质功能，还参与核体的组装与功能调节，影响mRNA的稳定性和翻译，并在信号通路中发挥调控作用。

4. 研究的不足与挑战：尽管取得了显著进展，lncRNA的生命周期及其作用机制仍未得到完整的注释。研究者们尚未完全解答一些关键问题，如lncRNA的具体转录时间、分布位置、作用方式及其功能。

5. 未来的技术展望：作者提出，最近在测序、成像、动物模型、质谱以及结构生物学计算建模方面的技术进步，有望加速对lncRNA的特定功能途径、分子机制和相关表型的理解。这将有助于进一步揭示lncRNA在基因调控中的独特作用。

链接lncRNA的加工、亚细胞定位与功能

随着RNA-seq分析的深入，已揭示了在多种细胞刺激和生理病理学环境中lncRNAs的差异表达。这种分析可以精确定位在后续功能研究中最适合研究的异常表达lncRNAs1。通过将报告基因（例如荧光蛋白）敲入内源性lncRNA启动子的技术，可以在全基因组范围内识别影响lncRNA表达的因子。例如，这种方法成功揭示了NEAT1_2（一种核体结构——伪核的lncRNA支架）的表达在应对线粒体刺激时上调，从而建立了伪核与线粒体之间的交互联系2。

然而，解读lncRNA的表达模式并不足以指示其作用方式。许多lncRNAs在细胞类型、组织和物种特异性上表现出不同的异构体，例如通过长读长测序结合5' RACE（cDNA末端快速扩增）来鉴定靶基因座上延长的5'末端，显示出频繁的选择性剪接事件3。此外，经过不同加工的lncRNA同源物可以具有不同的亚细胞定位模式，从而具有独特的功能。例如，一对lncRNA同线性同源物hFAST和mFast在人体和鼠类胚胎干细胞（ESCs）中分别表现出细胞质和细胞核的定位模式。hFAST在人体ESCs中促进Wnt信号传导，并且对于维持多能性是必需的，而核富集的mFast在鼠ESCs中没有可测量的影响。这种不同的亚细胞定位归因于由剪接抑制因子PPIE调节的独特RNA加工4。lncRNAs的不同亚细胞定位还受到顺式元件的调控，例如hFIRRE中的重复RNA域（RRD）序列指导其在人体细胞中的细胞质定位，而缺乏RRD的mFirre则主要定位于细胞核5。长读长测序技术能够生成完整的异构体读数，结合更好的计算工具进行数据分析，将改善异构体差异表达分析，促进在不同环境中lncRNA异构体的表达谱研究6。

解释：

这一段文字深入探讨了lncRNA的加工、亚细胞定位及其功能之间的联系，特别是如何通过技术手段揭示这些关系。以下是几个关键点：

1. 差异表达与功能研究：RNA测序（RNA-seq）揭示了lncRNA在不同生理和病理状态下的差异表达。这些差异表达的lncRNA可以作为功能研究的目标。通过敲入报告基因，如荧光蛋白，可以在基因组范围内检测影响lncRNA表达的因子。这类研究有助于理解lncRNA如何应对不同的细胞刺激，例如NEAT1_2在应对线粒体刺激时表达上调，揭示了伪核与线粒体之间的交互关系。

2. 表达模式与功能之间的差异：仅仅了解lncRNA的表达模式是不够的。lncRNA可以有多种异构体（不同的RNA分子形式），这些异构体在不同的细胞类型、组织或物种中表现出不同的功能。例如，hFAST和mFast是两个同源lncRNA，它们在人体和小鼠胚胎干细胞中具有不同的亚细胞定位（细胞质与细胞核）。这种定位差异导致它们功能的不同，hFAST参与了Wnt信号通路并维持人体胚胎干细胞的多能性，而mFast在小鼠胚胎干细胞中没有明显作用。

3. RNA加工与亚细胞定位的关系：不同的RNA加工方式（如剪接）会导致lncRNA的亚细胞定位差异。文章举例指出，由剪接抑制因子PPIE调控的剪接事件导致了hFAST和mFast不同的定位。此外，顺式作用元件（如hFIRRE中的RRD序列）也会决定lncRNA的定位，如在人类细胞中的hFIRRE定位于细胞质，而缺少RRD的mFirre则主要位于细胞核中。

4. 技术展望：长读长测序技术能够读取完整的RNA异构体序列，结合更先进的计算分析工具，可以改善对lncRNA异构体的表达分析。这将有助于在不同生理和病理背景下，研究lncRNA的不同异构体及其作用机制。

通过亚细胞分级分离和在整体细胞中进行的RNA测序（RNA-seq），以及在单细胞中使用单分子荧光原位杂交（smFISH），研究发现许多lncRNAs在加工效率低下且滞留在细胞核中，这与它们在染色质组织、转录以及核凝聚体中的广泛作用相一致。然而，一些剪接后的lncRNAs被输出到细胞质中，并定位于特定的细胞器，如线粒体和核糖体，发挥调控作用。除了通过smFISH进行的传统成像，由于lncRNAs较大的分子长度，研究人员可以设计多种smFISH探针，产生强信号，用于超分辨率显微镜观察，如结构照明显微镜（SIM）和随机光学重建显微镜（STORM）。早期应用这些成像技术揭示了多梳抑制复合体2（PRC2）与Xist lncRNA之间的短暂相互作用，澄清了PRC2在未来失活的X染色体（XCI）上核聚Xist沉默扩散的争议性作用。这些技术扩展了早期对核、细胞质和染色质相关lncRNA的观察到亚细胞器水平，深化了对伪核中高度有序的NEAT1_2的理解，揭示了SLERT调控的核仁纤维中心（FC）和致密纤维成分（DFC）单元的生物物理特性，阐明了多价NORAD–Pumilio小体在控制基因组不稳定性中的作用，以及关键因子SPEN在Xist RNA定位、稳定性和动态耦合行为中的独特功能。

解释：

这段文字详细介绍了长非编码RNA（lncRNA）在细胞中的定位与功能，特别是使用先进的成像技术对其作用的深入研究。下面是一些关键点的详细解释：

1. lncRNA的核内保留和细胞质输出
大多数lncRNA滞留在细胞核内：通过技术手段发现，许多lncRNAs由于加工效率低下而滞留在细胞核中。这与它们的主要功能有关，如调控染色质结构、参与基因转录以及在核凝聚体（如伪核）中的作用。
部分lncRNA被输出到细胞质：一些剪接后的lncRNAs被运输到细胞质，在特定的细胞器（如线粒体和核糖体）中定位，并在这些位置发挥调控作用。这表明lncRNAs不仅在细胞核内发挥作用，在细胞质中它们也有特定的调节功能。
2. 成像技术的进展
smFISH（单分子荧光原位杂交）：传统的smFISH技术用于检测单个细胞中的特定RNA分子，由于lncRNAs的分子长度较大，研究人员可以设计多个探针，以产生更强的信号。
超分辨率显微镜：如结构照明显微镜（SIM）和随机光学重建显微镜（STORM），这些技术能够以超高分辨率观察lncRNA在细胞中的定位及其动态行为。例如，使用这些技术，研究人员能够观察到PRC2和Xist lncRNA之间的短暂相互作用，从而解答了一些有关X染色体失活（XCI）过程中的争议。
3. lncRNA在亚细胞器水平的功能
伪核中的NEAT1_2：伪核是一种细胞核内的凝聚体，NEAT1_2是它的lncRNA支架。研究发现NEAT1_2在伪核中有高度有序的结构。
核仁中的SLERT：SLERT控制了核仁纤维中心（FC）和致密纤维成分（DFC）的生物物理特性，这些成分是核仁的重要组成部分，参与核糖体的生物合成。
NORAD与基因组不稳定性：NORAD是一种lncRNA，激活后会与Pumilio小体相互作用，帮助控制基因组的稳定性。这表明lncRNA在维持基因组完整性方面具有重要作用。
SPEN与Xist lncRNA：SPEN是Xist RNA中的关键调节因子，它影响Xist RNA的定位、稳定性及其动态行为。这进一步揭示了lncRNA在染色质调控中的复杂作用。
4. 技术推动了对lncRNA的深入理解
通过结合先进的成像技术和分子生物学方法，科学家能够更精确地追踪lncRNA在细胞中的定位、行为及其与其他分子的相互作用。这些技术让研究人员不仅能够观察lncRNA的细胞核或细胞质中的分布，还可以深入了解它们在特定细胞器中的动态功能。

总结：这段内容强调了lncRNA的加工和定位在细胞内的重要性，并展示了先进成像技术如何帮助科学家揭示lncRNA的复杂功能，特别是在调控染色质、维持基因组稳定性以及在亚细胞器中的作用。这些技术大大扩展了我们对lncRNA生物学作用的理解。

理解lncRNA的相互作用伙伴、结构模块和化学计量关系

要理解特定lncRNA的细胞功能，关键在于lncRNA-蛋白质（lncRNP）复合物如何组装和调控。目前有多种方法可以用来检测lncRNP的形成和调控，通常使用感兴趣的RNA或蛋白质作为诱饵来捕捉相互作用的伙伴。结合定量质谱技术（如ChIRP（通过RNA纯化分离染色质）、CHART（实时染色质可及性）和RAP（RNA反义纯化））以及RNA测序（如RIP（RNA免疫共沉淀）、iCLIP（单核苷酸分辨率的紫外线交联免疫共沉淀）和eCLIP（增强交联免疫共沉淀）），这些分析能够在某一特定时刻生成lncRNA的全局相互作用网络16。尽管这些先进技术令人兴奋，但同样重要的是使用经典方法（如电泳迁移率变动实验）从大量数据中验证真实的lncRNP相互作用。个体实验验证不仅能进一步确认相互作用，特别是对新发现的相互作用，而且可以作为证明大规模分析准确性的案例研究。此外，超分辨率成像和其他单分子方法也用于在单细胞中实时研究lncRNP复合物的组装13,14。

仅仅知道lncRNA的蛋白质伙伴还不足以理解它们如何协同工作。这是因为单链RNA分子具有动态折叠性，而且其大尺寸使得它们能够形成不同的结构模块，允许lncRNA与相同或不同的蛋白质结合以执行功能（图1b）。化学探测技术，如SHAPE-MaP17，已经被广泛应用于理解lncRNA的关键二级结构模块。可以在细胞中或体外进行这些实验，且可选择是否包括相互作用的蛋白质，以获得lncRNA构象如何影响RNA结合蛋白（RBP）的结合及其相互作用的必要信息。大多数lncRNA可能包含短的功能模块，而不是依赖整个序列发挥功能。例如，小鼠Xist（17,918个核苷酸）的5'区域包含A-F重复序列（称为RepA元件），这些元件对招募不同蛋白质集合以促进未来X染色体失活（XCI）至关重要。通过化学探测均匀折叠的RNA并进行建模，生成了RepA功能域的三维结构模型，显示了lncRNA分子内的三级结构18。最近的化学探测方法已经发展到能够在活细胞中分析长RNA上的协同功能蛋白相互作用网络19，并能够探测单分子水平的RNA二级结构，揭示lncRNA的结构构象可以响应外部条件发生变化20。相对而言，分析较短lncRNA的折叠状态较为简单，例如hFAST（576个核苷酸）。化学探测分析检测到hFAST中的多个模块，这些模块能够增强其与E3连接酶b-TrP结合的能力，在Wnt信号关闭状态下参与其去构建复合物，导致可测量的b-TrP隔离以促进Wnt活性在人类胚胎干细胞中的发挥4。总之，最近对lncRNA及其相关lncRNP复杂性的综合研究，包括绝对丰度、亚细胞和亚细胞器定位、关键RBP结合基序、结构模块及其动态变化，已经使我们对lncRNP的化学计量关系及其作用模式有了更好的认识。

解释：

这一段介绍了如何通过研究lncRNA的相互作用伙伴、结构模块及化学计量关系，来深入理解它们的功能。以下是详细解释：

1. lncRNA与蛋白质的相互作用（lncRNP复合物）

lncRNA在细胞中经常与蛋白质形成复合物，称为lncRNP复合物。理解这些复合物的组装和调控对于理解lncRNA的功能至关重要。研究人员使用RNA或蛋白质作为“诱饵”来捕捉它们的相互作用伙伴，并通过定量质谱（如ChIRP、CHART、RAP）和RNA测序技术（如RIP、iCLIP、eCLIP）来分析这些相互作用。

这些技术使得研究人员能够在某一特定时刻生成lncRNA的全局相互作用网络图，展示了lncRNA如何与其他分子相互作用。然而，为了确保这些相互作用是正确的，经典方法（如电泳迁移率变动实验）仍然用于验证数据的准确性。

2. lncRNA的结构模块和功能

lncRNA是单链分子，其结构非常灵活且复杂。它们可以动态折叠，形成多个结构模块，这些模块允许lncRNA与不同的蛋白质结合，执行不同的功能。比如，同一个lncRNA的不同区域可能会与不同的蛋白质结合，从而在细胞的不同位置发挥不同作用。

研究人员使用化学探测技术（如SHAPE-MaP）来分析lncRNA的二级结构，这些结构可能影响lncRNA与蛋白质的结合。通过这种方法，科学家们能够识别出哪些结构模块对于特定功能至关重要。

3. 化学计量关系和结构模块的研究

化学计量关系指的是在lncRNP复合物中，lncRNA与其结合蛋白的数量和比例。大多数lncRNA的功能可能依赖于短的结构模块，而不是整条RNA序列。例如，Xist lncRNA的5'端包含一些特定的结构元素（如RepA），这些元素负责招募蛋白质以实现X染色体失活。

化学探测技术还可以用于在活细胞中研究lncRNA如何与蛋白质形成相互作用网络，并探测lncRNA的二级结构如何随着外界条件的变化而改变。

4. 实例：hFAST和Xist lncRNA

• Xist lncRNA：小鼠Xist RNA的5'端区域有A-F重复序列（RepA），这些区域负责招募蛋白质来促进X染色体失活。通过化学探测，研究人员能够为RepA生成三维结构模型，帮助理解它如何执行其功能。
• hFAST lncRNA：hFAST是一种较短的lncRNA，化学探测揭示了它包含多个结构模块，这些模块增强了它与E3连接酶b-TrP的结合能力，从而在Wnt信号关闭时帮助调节b-TrP。

5. 结论

通过综合分析lncRNA的相互作用伙伴、结构模块及其动态变化，研究人员能够更深入理解lncRNP复合物的功能和作用机制。这种研究为揭示lncRNA在基因调控中的具体作用提供了基础。

总结来说，这段内容强调了先进的技术在帮助我们理解lncRNA如何通过其相互作用伙伴、结构模块及化学计量关系来执行复杂的细胞功能中的重要性。

探索lncRNA表型

分析lncRNA的加工和亚细胞定位（图1a）是后续功能研究的前提，通常使用反义寡核苷酸（ASO）或基于干扰RNA（RNAi）的方法，分别优先靶向核内或细胞质的lncRNA。在早期研究中，核内lncRNA的敲低效率常常受到ASO或其他工具的低效性和瞬时性影响。同样具有挑战性的是，使用市售载体过表达感兴趣的lncRNA，这些载体通常设计用于增强mRNA的核质输出，但常导致不恰当的亚细胞定位模式21。为了应对这些挑战，研究人员通过使用锌指核酸酶在核内lncRNA MALAT1的3'末端整合RNA不稳定化元件22，或使用TALEN（转录激活因子样效应核酸酶）技术在内源性lncRNA位点敲入一个强启动子21。

尽管早期的表型研究因低效的基因编辑21,22和经典的Cre-loxP23系统受限，CRISPR-Cas9技术极大地加速了lncRNA的细胞表型研究，几乎成为当前lncRNA研究的常规工具24-26。然而，值得注意的是，与蛋白质编码基因的功能丧失（LoF）研究中引入移码突变不同，通常需要进行大规模的基因组删除来破坏关键的lncRNA序列24。在某些情况下，调控作用并非来自lncRNA本身，而是来自lncRNA基因座的转录过程或DNA元件26-28。因此，在这类情况下，研究人员应更加谨慎地表征lncRNA和其基因座。为了避免大规模片段删除，已经开发了基于CRISPR的lncRNA基因抑制（CRISPRi）和激活（CRISPRa）实验，通过将催化失活的CRISPR-Cas系统与转录因子结合，用于不同环境中的功能筛选25,26,28-30。这些新进展大大促进了lncRNA功能研究，揭示了lncRNA在细胞增殖、组织稳态和药物抗性中的调控作用25,28-30，此外还使用人脑类器官模型鉴定了胶质瘤中的潜在lncRNA治疗靶点31。

解释：

这段文字讨论了如何使用各种技术工具来研究长非编码RNA（lncRNA）的表型，即其在细胞中的功能和作用。这些工具帮助研究人员确定lncRNA对细胞过程的影响，如细胞增殖、组织稳态、药物抗性等。以下是具体的解释：

1. 靶向lncRNA的技术工具

• 反义寡核苷酸（ASO）和干扰RNA（RNAi）：这些技术用于敲低（降低表达）特定的lncRNA。ASO是设计用于与lncRNA互补结合的小片段DNA，能够阻止lncRNA的功能，而RNAi通过降解目标lncRNA来降低其表达。研究中使用这些技术靶向核内或细胞质中的lncRNA，但这些方法有时会因为效率低下或效果短暂而受限。

• 过表达lncRNA的挑战：为了研究lncRNA的功能，研究人员有时会在细胞中过表达特定的lncRNA。然而，过表达的lncRNA可能会错误地定位于细胞中的不适当位置，导致不准确的实验结果。

2. 改进的技术：基因组编辑

• 锌指核酸酶和TALEN：这些是早期的基因编辑技术，用于在lncRNA基因组中插入或删除特定的DNA片段。例如，研究人员通过使用这些工具在核内lncRNA MALAT1的3'末端整合了一个能使其快速降解的“RNA不稳定化元件”，从而更好地控制其表达。

• CRISPR-Cas9：这一技术极大地加速了lncRNA功能研究。CRISPR-Cas9能够精确地剪切DNA，删除或修改特定的基因区域。这种技术的出现使研究人员能够更快速、更有效地研究lncRNA在细胞中的作用。

3. 大规模基因组删除的必要性

研究lncRNA的功能往往需要大规模的基因组删除，而不是简单的突变。原因是，许多lncRNA的功能不仅依赖于它们的RNA分子本身，还可能依赖于它们的基因座或转录过程。如果只破坏lncRNA的序列，而不删除它的整个基因座，可能无法完全消除它的调控作用。

4. CRISPRi和CRISPRa

• CRISPRi（CRISPR干扰）：这是基于CRISPR-Cas系统的一个变体，用于抑制特定基因的表达，而不必删除基因。这种方法将失活的Cas9蛋白与转录抑制因子结合，从而关闭目标lncRNA的表达，而不影响其他基因区域。

• CRISPRa（CRISPR激活）：与CRISPRi相反，CRISPRa用于激活目标基因的表达。通过将失活的Cas9与转录激活因子结合，可以增强特定lncRNA的表达，用于功能研究。

5. 功能研究的进展

这些技术帮助研究人员揭示了lncRNA在细胞增殖、组织稳态和药物抗性中的调控作用。例如，通过在人类脑类器官模型中研究，发现了一些可能作为治疗靶点的lncRNA，特别是在治疗胶质瘤（脑癌）中具有潜力。

总结

这段讨论了用于研究lncRNA功能的各种技术工具，尤其是CRISPR-Cas9技术的应用，使得科学家能够更加高效和精确地进行lncRNA的表型研究。这些技术进展帮助揭示了lncRNA在细胞生物学中的多种重要作用，并为未来的治疗研究提供了可能的方向。

挑战与机遇

毫无疑问，lncRNA介导的基因调控的多方面作用为基因调控的中心法则增添了一个新的维度。然而，在全面解析它们的功能时，仍面临多个层次的挑战。需要在正常、发育和疾病状态下，以时空方式表征lncRNA及其异构体。这方面的研究有待进一步发展。结合新的动态转录组学工具和长读长测序技术，将有助于在原位区分不同RNA异构体的时空模式。除了在不同环境中的转录组学和单细胞分析外，理解单细胞中lncRNA的加工和降解过程，以及它们在亚细胞器水平的定位模式和相互作用蛋白，将是一个重要的研究方向。这些研究可以使用超分辨率成像技术，以及最近开发的适配体、化学探测和基于CRISPR的方法，以更好地揭示lncRNA的生物功能。

理解lncRNA与大分子的相互作用如何发生，是解析其调控机制的关键。例如，在染色质、凝聚体和信号通路中的调控机制。最近开发的RNA和DNA SPRITE（RD-SPRITE）方法可以全面绘制RNA和DNA的空间组织图，从而识别RNA在促进细胞核空间区室形成中的作用。更具体地，从lncRNP的角度来看，RNA的多样功能依赖于其在特定的亚细胞定位，在那里它们采用特定的结构模块并与不同的相互作用伙伴结合，而这些过程可以响应局部亚细胞环境发生动态变化（图1b）。在深入理解动态的RNA–蛋白质相互作用时，空间和化学计量的分辨率挑战主要源于（lnc）RNA分子的固有灵活性和结构异质性，这些分子对传统的结构解析工具（如冷冻电子显微镜（cryo-EM）和X射线晶体学）具有抗性。因此，我认为需要多层次的方法，在单分子水平和实时条件下识别和可视化RNA–蛋白质相互作用（图1b）。这些方法可能包括基于交联免疫共沉淀（CLIP）的实验，用于绘制RNA结合蛋白（RBP）与lncRNA初级序列的结合图谱，化学探测和计算建模用于解析lncRNA的关键功能模块，并了解是否存在相对稳定的二级和三级相互作用，最终目标是在原子分辨率上解析lncRBP复合物的空间结构。例如，最近开发的Ribosolve软件流水线为冷冻电镜引导的三维RNA结构解析提供了一种方法；如果将该筛选和建模技术应用于已确定的lncRNA二级结构模块，可能会为lncRNP结构元素提供一些新的见解。还应注意的是，单个lncRBP复合物的行为和化学计量关系可能会根据环境线索发生动态变化（图1b）。尽管如此，以高分辨率动态解析lncRNP相互作用将为关键的RNA结构–功能关系提供重要见解。最后，随着新型、多功能CRISPR–Cas和CRISPR碱基编辑工具的应用，预计lncRNA的功能将被更好地解析。由于同线性lncRNA的快速进化可能导致lncRNA的定位和丰度的变化，进而可能导致不同的lncRNA功能，相关的表型分析、疾病模型和治疗潜力需要使用动物模型和人类类器官进行体内研究。这些体内分析将有助于重新捕捉与特定lncRNA相关的真实发育和疾病缺陷，避免在不同细胞环境中的表型模糊性。

在天文学领域，詹姆斯·韦伯太空望远镜的开发作为一项新工具，正为我们提供惊艳的宇宙照片。同样，我相信，随着lncRNA研究中工具和方法的不断发展，将会为lncRNA的何时、何地以及如何表达和作用带来令人惊叹的新见解。

解释：

这一段讨论了研究lncRNA功能时面临的挑战以及相关的技术机遇。以下是详细的解释：

1. 时空表征的挑战

• 理解lncRNA的时空表达模式：要深入理解lncRNA在正常发育、疾病等不同状态下的功能，首先需要弄清楚它们在这些条件下的时空表达模式。不同的lncRNA及其异构体在不同时间和空间环境中可能会表现出不同的功能。
• 结合新技术工具：通过长读长测序和动态转录组学工具的结合，研究人员可以捕捉到lncRNA的时空表达模式。这些技术能帮助区分不同的RNA异构体及其在细胞中的动态变化。

2. 单细胞水平的研究

除了研究lncRNA在不同状态下的转录组，还需要理解它们在单细胞中的加工和降解过程，并确定它们在亚细胞器中的定位。使用如超分辨率成像和化学探测等技术可以帮助揭示这些方面。

3. lncRNA与大分子的相互作用

理解lncRNA如何与其他大分子（如蛋白质、DNA等）相互作用，是解析其调控机制的关键。最近开发的RNA和DNA SPRITE技术，可以全面绘制RNA和DNA在细胞核中的空间组织，揭示lncRNA在染色质、凝聚体和信号通路中的作用。

4. 结构异质性与动态变化

lncRNA分子具有固有的结构异质性和灵活性，这使得使用传统的结构解析工具（如冷冻电镜和X射线晶体学）来研究它们的结构变得困难。因此，研究人员需要通过多层次的方法来解析lncRNA与其结合蛋白的相互作用。包括：

• CLIP实验：通过交联免疫共沉淀实验来绘制RNA与RNA结合蛋白（RBP）之间的结合图谱。
• 化学探测和计算建模：这些方法能够帮助研究lncRNA的关键结构模块，并帮助确定其二级和三级结构。

5. CRISPR技术的进步

CRISPR–Cas9以及基于CRISPR的碱基编辑工具的发展，为解析lncRNA的功能提供了新的手段。这些工具可以精准地调控lncRNA的表达，进而帮助研究其在不同细胞状态下的功能。

6. 动物模型和人类类器官的应用

由于lncRNA的进化速度快，它们的功能和定位在不同物种之间可能有所差异。因此，动物模型和人类类器官（如大脑类器官）在研究lncRNA的疾病模型和治疗潜力时尤为重要。这些模型能够帮助研究人员更真实地模拟lncRNA的作用，从而避免因不同细胞环境而产生的表型模糊性。

7. 类比詹姆斯·韦伯望远镜的工具进步

作者将lncRNA研究工具的发展与天文学中的詹姆斯·韦伯太空望远镜作类比，说明随着技术进步，研究人员将获得前所未有的新见解，揭示lncRNA的表达时间、位置及其作用机制。

总结

本文段落提出了lncRNA研究领域中的挑战，并强调了通过多种先进技术，如CRISPR、RNA测序、超分辨率成像等，可以帮助科学家更好地理解lncRNA的功能、结构和相互作用。作者相信，随着工具和方法的不断进步，lncRNA研究将迎来更多令人惊叹的发现。