空间与单细胞转录组学的整合定位肾损伤中上皮细胞与免疫细胞的相互作用

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在空间转录组图谱中对人类肾脏进行无监督映射和细胞类型鉴定
我们试图在H&E染色的人类参考肾切除标本组织切片上直接映射转录组特征。该组织来自一名59岁的女性，其肾小球闭塞和间质纤维化程度最低（分别影响不到10%的肾小球或肾实质）。未观察到动脉小管玻璃样变。通过显微镜对嵌入OCT化合物的组织切片进行H&E染色后，进行了组织渗透、RNA提取以及通过带有空间定位条码的测序，将转录组特征直接映射回组织学图像。

空间转录组映射的结果是一组“点”（直径55 μm），每个点都有其独特的表达特征。这些点基于定位条码叠加在肾脏的组织学图像上（图1A和B），并根据每个点的基因表达以无监督方式聚类。这些簇的身份通过已知的肾脏区域和细胞类型的标志基因及其下的组织学特征来确定和命名。通过Space Ranger生成了9个无监督簇（图1B），其表达特征与已知的肾小球和各种小管亚段的标志基因一致。这些簇叠加在组织学特征上，包括肾小球、小管、血管结构和髓放线区域，这些特征可以清晰观察到。

平均每个点测量到10,270个计数，检测到3205个基因。每个簇检测到的平均独特基因数量为17,506个，每个簇至少检测到16,000个基因。分配给某个簇的点始终定位在预期的组织学特征之上。簇映射和鉴定的一个例子见图1C–I。一部分标志基因列于图1J中，完整的基因集见补充表1；补充材料可在线获取：https://doi.org/10.1172/jci.insight.147703DS1。

提供了一张H&E切片的局部放大图，分别在未叠加（图1C）和叠加无监督聚类结果的情况下展示（图1D和E）。可以观察到肾小球、小血管、小管和部分髓放线区域。与肾小球基因（红色）相关的转录组学点明确地位于组织学上鉴定的肾小球区域。包含成纤维细胞、血管平滑肌细胞（VSMC）和内皮细胞标志基因表达的间质簇定位在血管区域（粉色）。虽然OCT嵌入切片中的小管形态不够完美，但仍能观察到区别。

空间转录组定义的近端小管（PT）簇位于无可见腔的嗜酸性小管区域。这种组织学模式与巨蛋白（LRP2）的表达相对应（图1F）。分配给粗升支（TAL）簇的点集中在髓放线区域，与对袢利尿剂敏感的钠-钾-2氯转运蛋白（SLC12A1）表达相关（图1G）。远曲小管（DCTs）和连接小管（CNTs）的特点是具有开放腔的小管，并表现出嗜酸性。在DCTs中，对噻嗪类敏感的钠-氯转运蛋白（SLC12A3）的表达水平较高（图1H）。集合管（CDs）在组织学上通过其特有的立方细胞核和减弱的嗜酸性被鉴定。这些小管与具有高水通道蛋白-2（AQP2）表达的点重叠（图1I）。

由于每个空间转录组点的直径为55 μm，与小管横截面的大小相当，这些点可能包含多个细胞类型。在无监督映射中，获得了两个PT簇和两个TAL簇。每组中各有一个簇显示出更强的已知标志基因富集，标记为“纯簇”。而标志基因富集较少或包含两个或多个细胞类型特征的簇被标记为“混合簇”。混合TAL簇出现在髓放线的边缘区域，而纯簇则更靠中心（图1B）。

正如所述，斑点是根据肾脏细胞类型的已知基因表达标记进行聚类分类的（图1J和补充表1）。根据它们的基因表达特征进行分类的斑点，一致地映射到了预期的组织学/肾脏结构。我们在5个随机选择的领域中评估了分配的转录组聚类与底层组织学的一致性（图1K）。分配的聚类与组织结构之间的整体相关性为97.6%。除了CD（90.7%）之外，所有聚类都以超过95%的准确度映射到了相应的组织学结构，CD在样本中的整体斑点数最少。不一致的最常见原因是斑点下方缺乏显著的组织（例如，位于边缘或大血管内的斑点）。将单核测序聚类映射到人类肾脏组织。通过Space Ranger获得的无监督聚类的均匀流形近似和投影（UMAP）图在图2A中提供。为了提高斑点映射的特异性并识别可能对斑点特征贡献较小的细胞类型，我们重新聚类了一个公开可用的人类肾脏样本的单核RNA测序（snRNA-Seq）数据集（图2B和参考文献2）。每个单细胞RNA测序（scRNA-Seq）聚类的DEG标记的完整列表在补充表2中。确定了30个细胞类型聚类。在一个与单细胞聚类整合类似的过程中（8），基于共同邻居的锚定，为30个snRNA-Seq聚类中的每一个分配了转移到空间转录组斑点的分数。然后每个斑点根据具有最高转移分数的snRNA-Seq聚类进行标记（图2C）。评估了无监督空间转录组聚类和根据snRNA-Seq转移分数重新标记的斑点之间的重叠百分比。在无监督空间转录组分类的斑点和用预期的snRNA-Seq转移标签重新定义的斑点之间发现了强烈的相关性。

一些在无监督空间转录组聚类中未被代表的细胞类型，在snRNA-Seq重新标记后被分配给了斑点。由于每个斑点覆盖了多个细胞，因此将细胞类型分配给了该55微米斑点中最占优势的细胞类型。例如，多种细胞类型共同贡献了间质（interstitium）的表达特征（9）。纳入snRNA-Seq数据集能够将定位在间质的斑点解析到更具体的一组细胞类型（图2，D-M）。该数据集允许区分分配给成纤维细胞、血管平滑肌细胞（VSMCs）和某些内皮细胞亚型的斑点。间质的已知标记物的特征图显示在图2，F-M中。细胞类型解混。由于每个斑点可能覆盖多种细胞类型，我们试图通过神经网络分析确定每个snRNA-Seq聚类对每个斑点表达特征的贡献（图3）。正如预期，足细胞、系膜细胞和内皮细胞聚类对覆盖肾小球的斑点贡献了最大比例的特征。在肾切除样本的右下方部分包含了一部分髓质。我们量化了与剩余样本相比，髓质中每个snRNA-Seq聚类产生的特征比例。在髓质中，定义了下降细肢、上升细肢和Henle厚升袢的基因表达富集。正如预期，在髓质中没有观察到足细胞特征的表达，S1和S2 PT的贡献最小。在原始的snRNA-Seq数据集中识别了两个皮质CD聚类（C16和C18）；然而，在空间转录组数据集中，C18的签名在皮质和髓质中都被发现，而C16专门映射到皮质。在小鼠肾脏中的空间转录组细胞类型定位。AKI并不均匀地影响肾脏的所有区域。伤害的病因可能会不同地影响基因表达的空间分布，特别是在疾病的早期。因此，我们将空间转录组应用于两种常见的小鼠AKI模型（IRI和CLP），并在6小时后对小鼠实施安乐死。图4显示了对照组、IRI和CLP模型的无监督空间转录组聚类映射。在3个模型的匹配横截面中，在6小时时间点用H&E染色观察到最小的组织病理学损伤（图4A）。在低倍放大下，IRI组织区域比对照组（16.9 mm²）和CLP（15.9 mm²）区域大（25.5 mm²）。图4B将每个部分与Space Ranger获得的聚类重叠。在IRI模型中只有两个聚类：间质和尿路上皮聚类，后者可能是由于部分中乳头的大小。将3个模型合并并标准化以允许模型之间的比较（图4C）。无监督空间转录组聚类之间的全套DEG在补充表3中。小鼠的细胞和管比人类小，因此每个55微米斑点由其主要贡献者标记。在小鼠中识别出的无监督聚类比人类少。例如，远端肾单位的DCT、CNT和CD都聚集在一起。同样，PT S3段聚类定位到外条纹，并包含邻近TAL的基因表达。用于识别聚类的标记基因子集显示在图4D中。PT聚类DEG的具体比较在补充图1中。