RNA-Seq 数据集、比对和标准化

RNA-Seq 数据集、比对和标准化|玉米中的元基因调控网络突出了功能上相关的调控相互作用。

RNA-Seq 表达分析代码和数据

该仓库是一个公开可用 RNA-Seq 数据集的集合（主要是玉米数据），提供了系统分析这些数据的代码/流程，以及质量控制（QC）和总结性数据输出。重点是大规模的 Illumina RNA-Seq 实验（包括多种组织/发育阶段、多个自交系/杂交系），但也包括使用其他测序技术（如 3’ RNA-Seq 等）进行的实验。

原始的测序读数从 NCBI Sequence Read Archive (SRA) 下载，使用 Trim Galore 或 fastp 进行修剪，随后使用 Hisat2 或 STAR 将其比对到玉米 B73 AGP_v4 基因组。唯一比对的读取被分配给 46,117 个参考基因模型（Ensembl Plants v37），并使用 featureCounts 进行计数。原始读取计数随后使用 TMM 标准化方法进行标准化，得到 CPM（每百万读取的计数值），然后通过基因 CDS 长度进一步标准化，得到 FPKM（每千碱基的外显子每百万读取的片段数）值。层次聚类和主成分分析（PCA）被用于探索样本聚类模式。

收集的数据集列表：

输出文件的详细说明

样本列表 / 元数据表：01.meta.tsv

• SampleID：样本ID
• Tissue：组织类型
• Genotype：基因型
• Treatment：处理方法
• Replicate：重复编号
• paired：是否为双端（paired-end）测序
• spots：读取数（单端）或对数（双端）
• avgLength：平均读长

结果文件，包括修剪和映射QC统计、原始读数计数及标准化的CPM / FPKM表：

01.rds

• 可通过 x = readRDS("01.rds") 在R中加载，包含以下数据框：
  • th：样本列表 / 元数据表，与 01.meta.tsv 相同
  • trimming：修剪统计
    • sid：样本ID
    • passed_filter_reads：通过过滤的读取数
    • low_quality_reads：低质量的读取数
    • too_many_N_reads：包含过多N的读取数
    • too_short_reads：过短的读取数
    • too_long_reads：过长的读取数
  • bamstat：映射统计
    • sid：样本ID
    • pair：双端对
      • pair_bad：失败QC的对数
      • pair_dup：重复的对数
      • pair_map：映射的对数（两个端）
      • pair_orphan：仅一个端被映射的对
      • pair_unmap：未映射的对
    • unpair：单端（单端读取或一个端未通过QC的对）
      • unpair_bad：失败QC的单端
      • unpair_dup：重复的单端
      • unpair_map：映射的单端
      • unpair_unmap：未映射的单端
    • pair_map_hq，pair_orphan_hq，unpair_map_hq：高质量（即唯一）映射的对数/读取数
    • pair_map0，pair_orphan0，unpair_map0：映射并且没有错配的对数/读取数
    • pair_map_hq0，pair_orphan_hq0，unpair_map_hq0：高质量（即唯一）且没有错配的对数/读取数
  • fcnt：来自 featureCounts 的原始读取计数
    • gid：基因ID（AGP_v4，Ensembl Plants v37，总共46,117个）
    • SampleID：样本ID
    • ReadCount：原始读取计数
  • salmon：来自salmon的原始读取计数和标准化的TPM（每百万转录本数）
    • gid：基因ID（AGP_v4，Ensembl Plants v37，总共46,117个）
    • SampleID：样本ID
    • ReadCount：原始读取计数
    • TPM：salmon标准化的转录本每百万数值（TPM）
  • salmon_tx：来自salmon的原始读取计数和标准化的TPM（转录本级别）
    • tid：转录本ID（AGP_v4，Ensembl Plants v37）
    • SampleID：样本ID
    • ReadCount：原始读取计数
    • TPM：salmon标准化的转录本每百万数值（TPM）
  • tl：文库统计
    • SampleID：样本ID
    • libSize：文库大小
    • sizeFactor：DESeq2文库大小因子
    • normFactor：edgeR文库标准化因子
  • tm：标准化表达表
    • gid：基因ID（AGP_v4，Ensembl Plants v37，总共46,117个）
    • SampleID：样本ID
    • ReadCount：原始读取计数
    • nRC：标准化读取计数（nRC = ReadCount / sizeFactor）
    • rCPM：原始CPM（每个样本/文库的总和为1,000,000）
    • rFPKM：原始FPKM（使用rCPM和基因外显子长度计算）
    • rTPM：原始TPM（每个样本/文库的总和为1,000,000）
    • CPM：通过edgeR计算的CPM（CPM = rCPM / normFactor）
    • FPKM：通过CPM和基因外显子长度计算的FPKM
    • TPM：标准化的TPM（TPM = rTPM / normFactor）
  • th_m：重复合并的样本列表 / 元数据表
  • tm_m：重复合并的表达表
  • ase_gene：基因级别的等位基因特异性读取计数
    • sid：样本ID
    • gid：基因ID
    • allele1，allele2：每个等位基因的特异性读取计数。例如，在Mo17xB73的情况下，allele1表示Mo17（第一）等位基因的计数，而allele2表示Mo17（第二）等位基因的计数
  • ase_snp：SNP级别的等位基因特异性读取计数
    • sid：样本ID
    • chr，pos，ref，alt：SNP信息
    • gt：样本在此位点的基因型（0|1或1|0）
      • 在1|0的情况下，等位基因1（母源等位基因）在alt状态，而等位基因2（父源等位基因）在ref状态
    • allele1，allele2：母源（第一）等位基因和父源（第二）等位基因的读取计数

biomap

biomAP mRNA-Seq 数据集分析

方法

结果

• 原始样本元数据表
• 修正后的样本元数据表：
  • 样本 bm252 从 Root 修正为 Leaf
  • MSI 路径：/home/springer/zhoux379/projects/rnaseq/data/05_read_list/me99c.c.tsv
• 中间文件都存放在 MSI 临时空间目录下：
  /scratch.global/zhoux379/rnaseq/me99c/，包括以下子目录：
  • 10_fastq, 15_trim：原始和修剪后的 fastq 文件
  • 21_star, 22_bam：原始 BAM 文件和坐标排序后的 BAM 文件
  • 31_featurecounts：读取计数表
  • 31_mmquant：原始读取计数
  • 33_ase：等位基因计数分析的中间文件

QC (质量控制)：

• [读取修剪和映射统计]
  

• PCA 图
  

• t-SNE 图：
  

  • 相较于 PCA 图，t-SNE 图显示了更好的组织分离效果
  • 叶片样本被分为两个不同的簇

• 映射统计表：
  包含每个样本的修剪、映射和计数统计，表格列出：

  • MSI 路径：/home/springer/zhoux379/projects/rnaseq/data/raw_output/bamstats.tsv
  • SampleID, Tissue, Genotype, Treatment, Replicate：样本元数据
  • 修剪统计：total, surviving, surviving_f, surviving_r, dropped
  • 映射统计：
    • pair：读对
      • pair_bad, pair_dup：映射失败的读对或重复读对
      • pair_map：映射的读对（两端）
      • pair_orphan：只有一端映射的读对
      • pair_unmap：未映射的读对
    • unpair：单端读取（或一端失败的配对）
      • unpair_bad, unpair_dup：映射失败的单端或重复单端
      • unpair_map：映射的单端读取
      • unpair_unmap：未映射的单端读取
    • pair_map_hq, pair_orphan_hq, unpair_map_hq：高质量（即唯一）映射的读对/单端
    • pair_map0, pair_orphan0, unpair_map0：无错配的映射读对/单端
    • pair_map_hq0, pair_orphan_hq0, unpair_map_hq0：高质量并且无错配的映射读对/单端
  • 读取计数统计：
    • Assigned：分配给外显子区域并计数的读取
    • Unassigned_MultiMapping, Unassigned_NoFeatures, Unassigned_Ambiguity, Unassigned_Unmapped：由于各种原因未计数的读取

ASE（等位基因特异性表达）分析：

• 每个样本的冲突读取比例：
  

  大部分样本中基因的冲突读取比例非常低（通常小于 2%），异常高的冲突读取比例可能表明样本基因型标注错误。

• 每个样本的父本等位基因比例：
  

  数字表示样本数（即基因数）。大多数自交系样本的父本等位基因比例为 0，而杂交样本的父本等位基因比例为 0.5，例外情况可能表明样本基因型标注错误。

R 数据文件

• MSI 路径：/home/springer/zhoux379/projects/biomap/data/41_qc/10.rc.ase.rda
• 包含原始读取计数表、标准化表达值和等位基因特异性读取计数：
• th - 样本信息表（tibble），包含以下列：
  • SampleID：样本编号（如：bm001 - bm467）
  • Tissue：样本组织（如：Leaf, Internode, Root 等）
  • Genotype：基因型（如：B73, Mo17xPH207 等）
  • Treatment：处理方式（如：replicate 1 或 2）
  • inbred：是否为自交亲本（TRUE 或 FALSE）
  • sizeFactor, libSize：使用 DESeq2 中位数对数比率法计算的库大小和标准化因子，用于库大小的校正
  • normFactor：使用 edgeR 中的 TMM 方法计算的标准化因子，不进行库大小校正
• tm - biomap 表达数据表（tibble）
  • gid：基因 ID（AGP_v4, Ensembl Plants v37，共 46,117 个基因）
  • SampleID：样本编号（如：bm001 - bm467）
  • ReadCount：原始读取计数
  • nRC：标准化读取计数（nRC = ReadCount / sizeFactor）
  • rCPM：原始 CPM（每个样本/库的总和为 1,000,000）
  • rFPKM：使用 rCPM 和基因外显子长度计算的原始 FPKM
  • CPM：使用 edgeR 计算的 CPM（CPM = rCPM / normFactor）
  • FPKM：使用 CPM 和基因外显子长度计算的 FPKM
• ta - 等位基因特异性计数表（tibble）
  • SampleID：样本编号（如：bm001 - bm467）
  • gid：基因 ID（AGP_v4 基因 ID）
  • n0, n1：分别支持父本和母本等位基因的读取数
  • ncft：支持父本和母本等位基因的冲突读取数，这种情况较少，通常是由于插入缺失区域的错配所致

biomAP 重测序数据集的短变异调用

方法

• 使用 [fastp] 对读取数据进行了修剪，使用 BWA 将数据比对到玉米 B73 AGP_v4 参考基因组。
• 对比对后的 BAM 文件进行重复标记和碱基重校准，使用 [GATK4] 工具进行处理。
• 针对每个样本使用 [GATK4] 的 HaplotypeCaller 调用 GVCF 文件，然后使用 [GATK4] 的 GenotypeGVCF 进行联合变异调用，生成原始的变异集。
• 接着，使用 [GATK4] 的 VariantRecalibration 对原始变异集进行过滤，生成最终的变异调用集。

结果

• 每个样本的 SNP 统计信息
• 每个样本的 Indel 统计信息
• 最终变异集：/home/springer/zhoux379/projects/biomap/data/variants/01.vcf.gz
• 样本基因型表与变异效应注释：/home/springer/zhoux379/projects/biomap/data/variants/10.tsv.gz
• 样本的系统发育树（待创建）