蛋白互作组学系列丨（三）IP-MS方案设计

上一期我们分享了IP-MS实验中实验材料的建议和要求，这一期我们将分享IP-MS实验中IP部分的具体方案设计。

1、实验组和对照组

在任何实验中，对照组的设置都是最关键的环节之一。控制变量是对照组设置的重要原则，在IP-MS中也是如此。在IP-MS实验中，质谱检测环节对于实验组和对照组是一致的，其差异主要体现在IP环节。目前常用的对照组设计方案主要有以下三种。

方案一通常能获得最好的IP和质谱检测效果，也是目前IP-MS实验中最常用的方案。但若某些实验要求尽量避免对细胞体系的刺激，或希望鉴定到更接近生理状态下、生物学意义更明确的蛋白相互作用，则会采用方案二针对细胞中内源性的野生型蛋白进行IP和检测。

另外，如果同时鉴定两个或以上不同蛋白的相互作用蛋白，且已知这些蛋白间不存在相互关联，则这些蛋白所属的实验组可互为对照。

2、重复实验

为了避免单次实验的偶然误差，在生物实验设计中往往需要设置多次重复。在IP-MS实验中，重复实验的设置对于筛选出高可信度的相互作用蛋白尤为重要。

在目前的IP-MS实验中，通常以蛋白的定量差异筛选相互作用蛋白。通过差异倍数和P值筛选是最通用的做法，而P值仅在３次及以上重复数据中才有意义，在单次实验中无法计算。

以Nature上发表的一项新冠病毒蛋白互作组学研究中的部分蛋白质组定量数据为例，提取其中病毒N蛋白相关的IP实验组和对照组数据，以相同的定量筛选标准筛选互作蛋白时（log2 Fold change>4，P<0.05），在使用4次重复数据和仅使用其中一次实验数据筛选出的互作蛋白数量如下所示。若以有其它文献报道的N蛋白互作蛋白占筛选出的差异蛋白的比例来评估互作筛选效果，二者互作筛选比例分别为26.9%和13.0%。可见，设置重复可以显著降低由单次偶然误差导致的假阳性结果，进而降低后期蛋白相互作用验证的工作量。

在近年来发表的IP－MS案例中，通常每组实验至少会设置３－４次重复实验。通常组学类型的论文期刊对此要求较严格，但若后续会经过多种其他方法对鉴定到的互作蛋白进行验证，而仅以IP-MS实验作为前期预实验，则无重复也可接收，但这种情况下由于其假阳性结果比例的升高，其互作蛋白筛选和验证的工作量也会急剧提升。

3、质谱检测前预实验

由于质谱检测的成本相对较高，建议在IP样品进行质谱检测之前，先取1/4均分为2份通过SDS-PAGE分别进行WB及染色预实验。WB预实验主要用于评估IP所用抗体的效果，银染或考染预实验主要用于评估IP之后的样本量。

若WB结果类似A1，表明所用抗体可以用于IP实验，且抗体特异性良好；若结果类似A2，则表明所用抗体可以用于IP实验，但抗体特异性较差，除目的蛋白外还会识别其他非目的蛋白，结果中假阳性率可能较高；若结果类似A3，则无法证明所用抗体能够特异性结合并免疫沉淀目的蛋白，一般不能用于IP实验。

若SDS-PAGE染色结果类似B1，表明两组IP样品中蛋白量较高且差异明显，质谱检测可分析出明显的蛋白差异从而鉴定相互作用蛋白；若结果类似B2，表明两组样品中蛋白含量较低或差异不明显，因而无法保证能通过质谱检测筛选出差异蛋白以鉴定蛋白相互作用。

综合两种预实验结果，若预实验结果为A1B1或A2B1，可以进行后续质谱检测，通常可以获得理想结果；若预实验结果为A1B2或A2B2，也可进行后续质谱检测，但结果难以保证；若预实验结果为A3B1或A3B2，建议优化和更改实验条件，重新制备样品后，再进行质谱检测。

4、参考实验步骤

1）用裂解液裂解细胞后soft模式4 ℃，20,000 ×g 离心15 min。

2）转移上清到新的1.5 mL EP管中，加入适量的抗体，4 ℃颠倒混匀至少2小时。

3）soft模式4 ℃，20,000 ×g 离心15 min，取上清液转移到新EP管。

4）将磁珠用裂解液平衡三次，加入步骤3中EP管，4 ℃颠倒混匀至少2个小时。

5）以磁力架分离磁珠，去掉上清溶液，用清洗液和置换液各清洗磁珠3次，去上清。

6）beads沉淀-80 ℃保存，可用于后续质谱检测，或SDS-PAGE预实验。

详细步骤可参考往期公众号文章“IP-MS 实验步骤”。

5、总结

1. 实验组与对照组间应尽量保证包括细胞、抗体用量等各项条件一致，只保留一项差异。简单来说，即在所用细胞系不同时，保证抗体种类一致；在所用抗体不同时，保证细胞类型一致。

2. 在条件许可情况下，尽量设计3-4次重复实验，可有效提高数据的可信度，降低互作蛋白验证的工作量。

3. 在获得IP样品之后，进行质谱检测之前，可通过SDS-PAGE电泳染色和WB预实验评估该IP样品是否适用于质谱检测。银染或考染可评估IP样品蛋白量，WB可评估IP抗体特异性和亲和富集效率。

参考文献

1. IWASAKI M, MINDER P, CAì Y, et al. 2018. Interactome analysis of the lymphocytic choriomeningitis virus nucleoprotein in infected cells reveals ATPase Na+/K+ transporting subunit Alpha 1 and prohibitin as host-cell factors involved in the life cycle of mammarenaviruses. PLoS Pathog [J], 14: e1006892.

2. MEIXNER A, BOLDT K, VAN TROYS M, et al. 2011. A QUICK screen for Lrrk2 interaction partners--leucine-rich repeat kinase 2 is involved in actin cytoskeleton dynamics. Mol Cell Proteomics [J], 10: M110.001172.

3. SHANG J, XIA T, HAN Q Q, et al. 2018. Quantitative Proteomics Identified TTC4 as a TBK1 Interactor and a Positive Regulator of SeV-Induced Innate Immunity. Proteomics [J], 18.

4. STUKALOV A, GIRAULT V, GRASS V, et al. 2021. Multilevel proteomics reveals host perturbations by SARS-CoV-2 and SARS-CoV. Nature [J], 594: 246-252.