免疫微环境、免疫细胞浸润分析、免疫功能分析

思路来源：
https://www.omicsclass.com/article/1437
https://www.bilibili.com/read/cv22219799/

01.肿瘤免疫微环境（TIME）

肿瘤免疫微环境（Tumor immune microenvironment）是指肿瘤细胞存在的周围微环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞、各种信号分子和细胞外基质。肿瘤和周围环境密切相关，不断进行交互作用，肿瘤可以通过释放细胞信号分子影响其微环境，促进肿瘤的血管生成和诱导免疫耐受，而微环境中的免疫细胞可影响癌细胞增长和发育。
对于免疫微环境有一个流行的学说——“种子与土壤”学说，肿瘤的发生发展是肿瘤细胞与其微环境相互影响、共同进化的结果。肿瘤微环境由不同种类的间质细胞和炎性介质以及细胞外基质（ECM）组成。其中肿瘤相关成纤维细胞是最主要的间质细胞；血管内皮细胞介导的血管新生为肿瘤生长和转移提供必需的营养；免疫浸润包括树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞及不同亚型的T细胞等等。肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤细胞可以通过分泌特殊的细胞因子形成正反馈循环促进肿瘤恶性表型的形成和维持。肿瘤微环境在肿瘤恶性进展、免疫逃逸和治疗抵抗中发挥重要作用,我们统计了近8年（截至2020.11）pubmed 收录的关于肿瘤免疫浸润的文章数目，可见一直呈增长趋势，热度未减。
肿瘤细胞和基质成分之间相互作用，形成了功能复杂的TME。肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）主要分布于血管周围或肿瘤外周纤维间质内，分泌细胞因子、ECM成分及相关酶分子。TME中有多种免疫浸润细胞，其中CD8+或细胞毒性T淋巴细胞（CTL）发挥肿瘤杀伤功能，而调节型T细胞（Treg）减弱T细胞活性，促进TME免疫抑制。一般M1型巨噬细胞发挥促炎和抗瘤作用，但TME中的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）为M2型，通过分泌Th2细胞因子促进血管生成和肿瘤侵袭。我们所熟知的NK细胞会释放颗粒酶和穿孔素杀伤靶细胞，但在TME中富集的TGF-β会抑制其杀伤活性。而树突状细胞（DC）也会受到TME中的缺氧和炎症影响消弱其抗原呈递活性。基质细胞类型和富集程度决定了TME特性，进一步影响着肿瘤进展和免疫应答情况。

02.TIME的免疫特点和相关机制

TME的异质性使得个体间肿瘤进展存在很大差异；肿瘤的免疫微环境一般分为豁免型和炎症型。炎症型肿瘤微环境中富集有活化的T细胞和髓系细胞，并由趋化因子、I型干扰素信号表达。相反“冷肿瘤”，既是免疫豁免型TME中，仅存在少量免疫细胞或抑制性亚群，如Treg、MDSC和TAM，而效应型免疫细胞无法有效浸润至肿瘤微环境。仅分布在外周基质，难以发挥抑癌作用。

03.检测免疫浸润的工具

肿瘤浸润情况对癌症治疗效果和患者预后有很大的影响，了解肿瘤微环境中免疫细胞的组成有助于揭示肿瘤异质性。利用RNA-seq技术进行基因表达谱分析可以表征肿瘤相关基因的表达谱，已广泛用于在许多癌症类型的研究。RNA-seq虽能提供基因表达信息，但并不能直接表征出免疫浸润情况，需要一定的算法进一步评估。

现有用于免疫浸润评估的算法可分为两大类：
（1）基于标记基因（marker gene）的肿瘤浸润免疫细胞量化方法；基于特征基因集的方法是通过使用组织样本中这些特征基因集的表达量，对基因集进行富集分析或将其汇总到丰度评分中来独立推断每种细胞类型的得分；其中代表的软件有TIminer、xCell、MCP-counter。另外还有一些评定免疫得分的软件如ESTIMATE；基于GSVA算法的ssGSEA，该方法将不同免疫细胞对应的marker genes作为基因集合, 采用类似GSEA的算法来评估样本中高表达的基因在不同免疫细胞的基因集合中是否富集。。

（2）基于表达特征对细胞混合物进行反褶积的肿瘤浸润免疫细胞量化方法。反卷积方法推断出数学方程式，该数学方程式是将组织样本的基因表达建模为种群混合物中细胞表达谱的加权总和。这两种互补的算法在估计不同肿瘤中特定的免疫细胞类型方面表现出不同的性能优势；相关软件有CIBERSORT、TIMER、EPIC、quanTIseq。

3.1.基于marker gene的ssGSEA富集分析的免疫分析方法

该方法将不同免疫细胞对应的marker genes作为基因集合, 采用类似GSEA的算法来评估样本中高表达的基因在不同免疫细胞的基因集合中是否富集。其代表性研究工具包括ssGSEA，xCell，MCP-counter，ESTIMATE等。

3.1.1.xCELL

xCell（http://xcell.ucsf.edu/ ）是基于 ssGSEA 的方法，可根据 64 种免疫细胞和基质细胞类型的基因表达数据进行细胞类型富集分析。Xcell 的输入文件是来自人类混合样本的基因表达矩阵（基因作为行，样本作为列）。如果基因表达数据来自微阵列，就不需要标准化。如果基因表达数据来自一个测序平台，数值必须被归一化为基因长度(例如，rpkm，tpm，fpkm)。Xcell 使用表达式级别排序，而不使用实际值，因此进一步的规范化不会产生影响。该方法适用于基因表达谱和RNA-seq数据，但不适用于单细胞数据。 作者：尔云间 https://www.bilibili.com/read/cv22219799/ 出处：bilibili

xCell (http://xcell.ucsf.edu/) 是2017年发表在Genome Biology杂志上公布的基于ssGSEA的方法工具，该方法可估计64种免疫细胞类型的丰度分数，包括适应性和先天免疫细胞，造血祖细胞，上皮细胞和细胞外基质细胞。

xCell基于从不同项目和研究的大规模表达数据中提取的489个基因集（FANTOM5, ENCODE, Blueprint, IRIS, Human Primary Cell Atlas (HPCA)和Novershtern等人的文章）。对于每种细胞类型，通过四个主要步骤计算xCell丰度得分：（1）使用R包GSVA对489个基因集单独进行ssGSEA；（2）在属于一种细胞类型的所有基因集的ES进行平均；（3）将特定平台的ES转换为丰度分数；（4）使用类似于用于流式细胞术数据分析的spillover方法校正紧密相关的细胞类型之间的相关性。尽管最终的xCell丰度分数不能直接解释为细胞分数，但它们与真实的细胞比例具有很高的相关性。

3.1.2.MCP-counter

MCP-counter (http://github.com/ebecht/MCPcounter ) 是由Becht团队于2016年开发的一个R包，该R包可以通过归一化后的转录组数据量化异质组织中8个免疫细胞和2个基质细胞的绝对丰度。分数的高低可以显示其在免疫微环境中的浸润程度，细胞之间的丰度不可互相比较。

MCP-counter (http://github.com/ebecht/MCPcounter) 是2016年发表在Genome Biology杂志上的一种基于标记基因集来量化肿瘤浸润免疫细胞、成纤维细胞和上皮细胞的方法。对于每种细胞类型和样品，将丰度得分计算为细胞类型特异性基因表达值的几何平均值。
由于分数以任意单位表示，因此不能直接将其解释为细胞分数，也不能在细胞类型之间进行比较。但是，使用定量验证显示估计分数与真实细胞分数之间具有高度相关性，从而证明了MCP-counter在样品间比较中的价值。为了证明这些估计的预后价值，MCP-counter已用于量化32个非血液学肿瘤中19000多个样本中的免疫细胞和非免疫细胞。

3.1.3.ESTIMATE

Estimate是一种使用基因表达特征来推断肿瘤样本中间质和免疫细胞比例的方法，全称为Estimation of STromal and Immune cells in MAlignant Tumor tissues using Expression data(使用表达数据估计恶性肿瘤中的间质和免疫细胞)。ESTIMATE算法基于ssGSEA算法对 stromal和immune 两个基因集进行打分，得到肿瘤样本的基质分数(stromal score )和免疫分数(immune score)，两个分数相加即得到estimate score，可用于估计肿瘤纯度。

Estimate是2013年发表在Nature communication杂志上的一种推断肿瘤微环境中免疫得分，基质得分及免疫微环境得分的工具。主要是利用能够表征基质和免疫细胞的基因集的表达信号进行估算。

ESTIMATE方法估计是基于TCGA数据库中的各种平台检测的样本表达量数据得到的10412个基因集，经过过滤最终确定基质信号基因集的141个基因和免疫信号的141个基因，通过这两个基因集的表达量通过ssGSEA算法最终确定Stromal score和Immune score,这两个得分相加即可得到Estimate score;这三个得分分别表征着免疫微环境中基质细胞的占比、免疫细胞的占比和肿瘤纯度。
ESTIMATE的R包脚本：

3.1.4.

3.1.5.ssGSEA

单样本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA），是针对单个样本无法做 GSEA 而设计的。最早是在 2009 年被提出（Systematic RNA interference reveals that oncogenic KRAS-driven cancers require TBK1），它可以使用 GSVA R 包来实现，目前 ssGSEA 常被用于评估肿瘤免疫细胞浸润程度。

作者：尔云间 https://www.bilibili.com/read/cv22219799/ 出处：bilibili

3.1.6.ImmuneCellAI

ImmuneCellAI（http://bioinfo.life.hust.edu.cn/ImmuCellAI#!/）是一个免疫细胞丰度综合分析网络平台，基于ssGSEA算法估算了包括RNA-Seq和微阵列数据在内的基因表达数据集中24个免疫细胞浸润丰度，同时可以预测患者对免疫检查点抑制剂治疗的反应。其中24个免疫细胞由18个T细胞亚型和6个其他免疫细胞组成：B细胞，NK细胞，单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和DC细胞。该网站分析功能较为突出，且图片比较精美，对新手小白来说真的是一个不错的选择。

作者：尔云间 https://www.bilibili.com/read/cv22219799/ 出处：bilibili

3.2.基于反褶积算法的免疫细胞浸润分析方法

该方法将每个样本看作是多种免疫细胞的混合，采用线性回归拟合出每种免疫细胞的组分和表达量与最终混合后的关系，通过反卷积算法，提取每种免疫细胞的表达特征，其中最常用的免疫浸润分析方法是TIMER2、CIBERSORT和EPIC： 作者：尔云间 https://www.bilibili.com/read/cv22219799/ 出处：bilibili

3.2.1.TIMER2.0

TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org/) 是TIMER软件的更新版本，作为一个可交互式web工具，能够全面、灵活的分析肿瘤免疫浸润免疫细胞并可视化。另外相关文章也是发表在了Nucleic Acids Research（IF=11.1）杂志上。

TIMER2.0版本主要包含Immune, Exploration, Estimate三大模块，可以手动输入RNA-seq的基因TPM标准化值，TIMER2.0综合六个软件的优势（TIMER, xCell, MCP-counter, CIBERSORT, EPIC和quanTIseq）给出120个免疫微环境相关细胞的得分；另外该软件还将TCGA数据库中的所有样本用这六个软件计算出了免疫得分，另外还提供了很多可视化的线上工具。

TIMER应用反褶积算法从基因表达谱中推断肿瘤浸润性免疫细胞（TIICs）的丰度。 TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org/ ) 是TIMER软件的更新版本，是一个可交互式web工具，能够对肿瘤免疫浸润细胞进行分析以及可视化。TIMER2.0版本主要包含Immune, Exploration, Estimate三大模块，可以手动输入RNA-seq的基因TPM标准化值。TIMER2.0综合TIMER, xCell, MCP-counter, CIBERSORT, EPIC和quanTIseq给出120个免疫微环境相关细胞的得分。另外该软件还基于以上六种方法对TCGA数据库中的所有样本进行免疫浸润分析，并提供多个可视化线上工具。

3.2.2.CIBERSORT

CIBERSORT算法 (https://cibersort.stanford.edu/index.php) 考虑了由microarray数据构建的特征矩阵，22种免疫细胞表型的表达特征，包括不同的细胞类型和功能状态的免疫细胞。CIBERSORT使用ν-SVR估计细胞得分。通过对血液和淋巴结活检细胞混合物的microarray数据进行验证，CIBERSORT被证明在在9个免疫细胞亚群和3个免疫细胞亚群的同时反褶积方面具有较高的准确性。通过对四种恶性免疫细胞类型的模拟混合物进行测试，它还证明了对不同程度的噪音和未知的肿瘤具有稳定性。
线上工具直接提交RNA-seq的表达量值就可以得到免疫微环境的22种细胞的得分。

CIBERSORT（ https://cibersort.stanford.edu/ ）是目前引用次数最多的免疫细胞浸润估计分析工具，2015年首次发表于Nature method。CIBERSORT利用线性支持向量回归的原理对免疫细胞亚型的表达矩阵进行去卷积，来估计免疫细胞的丰度。CIBERSORT 提供了 22 种常见的免疫浸润细胞表达数据 LM22，包括不同的细胞类型和功能状态的免疫细胞。其升级版CIBERSORTx不仅在于可以通过单细胞RNA-seq数据构建专属signature（各免疫细胞marker基因），还能够推测各免疫细胞特征基因表达谱，进一步将研究向机制方向伸展。

作者：尔云间 https://www.bilibili.com/read/cv22219799/ 出处：bilibili

3.2.3.EPIC

（https://gfellerlab.shinyapps.io/EPIC_1-1 ）可根据表达数据分析出8种免疫细胞的浸润比例，包括B细胞、 肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）、CD4+T细胞、 CD8+T细胞、 内皮细胞、 巨噬细胞和NK细胞。EPIC的算法思路是使用约束最小二乘回归将非负性约束条件明确纳入反卷积问题，并强加每个样本中所有细胞分数的总和不超过一。其使用简单，仅需提交RNA-Seq表达数据，设置参数，设置运行任务名称3步即可完成。