Nature｜纪念斯隆凯·特琳癌症中心发布有效率达50%的个性化RNA疫苗，强力阻断胰腺癌复发｜顶刊速递·24-09-14

小罗碎碎念

今日顶刊：Nature

2023年5月10日，纪念斯隆凯·特琳癌症中心、BioNTech、基因泰克（罗氏子公司）的研究团队合作，在国际顶尖学术期刊《Nature》上发表了题为：Personalized RNA neoantigen vaccines stimulate T cells in pancreatic cancer 的研究论文。

这篇文章是老板在群里推荐的，抗癌疫苗和肿瘤复发，这两个课题我都挺感兴趣的，所以早上一起来就开始着手分析这篇文章。

写这篇推文还有一个原因，就是作者单位中提到的基因泰克——瑞士罗氏制药集团在2009年3月26日出资约468亿美元全额收购了该公司。从我刚开始写推文的时候，他们公司就有人关注了我，一直保持着交流。所以虽然我是研究病理的，但是不妨碍我来学习一下这篇文章，哈哈。

一、文献速览

这篇文章研究了个性化RNA新抗原疫苗在胰腺癌中的免疫刺激作用。

1. 研究背景：
   • 问题：胰腺导管腺癌（PDAC）是一种高度致命的癌症，尽管手术是唯一的根治性治疗方法，但术后复发率高，5年生存率仅为8-10%。
   • 难点：PDAC的突变率低，产生的新抗原较少，导致免疫系统难以识别和攻击肿瘤细胞。此外，PDAC对免疫检查点抑制剂的反应较差，免疫疗法效果有限。
   • 相关工作：现有研究表明，PDAC患者肿瘤中实际上含有较多新抗原，且这些新抗原可以刺激T细胞反应，延长患者的生存期。因此，开发针对这些新抗原的个性化疫苗具有重要的临床意义。
2. 研究方法：

   • 本研究是一项I期临床试验，评估了辅助自基因cevumeran疫苗的安全性和可行性。该疫苗基于尿苷mRNA-脂质纳米颗粒，包含多达20个主要组织相容性复合体（MHC）I和MHC II限制的新抗原。

   • 研究对象包括34名患者，其中28名接受了手术。患者依次接受atezolizumab（一种抗PD-L1免疫疗法）、自基因cevumeran（最多20个新抗原/患者）和改良版的四药化疗方案（mFOLFIRINOX）。

   • 

   • 疫苗通过外科切除的PDAC肿瘤实时合成，并在手术后3天内快速给药。使用高阈值检测、18个月无复发生存期和肿瘤学可行性作为终点。

3. 实验设计：
   • 疫苗制备：从手术切除的PDAC肿瘤中提取DNA和RNA，通过全外显子测序和肿瘤RNA测序识别表达的非同义突变和新抗原。然后，使用生物信息学方法预测和排名新抗原的免疫原性。
   • 免疫反应评估：使用IFNy ELISpot和TCR Vβ测序（CloneTrack）评估疫苗诱导的新抗原特异性T细胞反应。IFNy ELISpot检测外周血样本中的高幅度T细胞反应，而CloneTrack用于追踪疫苗扩增的T细胞克隆。
4. 结果与分析：
   • 安全性：19名接受atezolizumab治疗的患者中有1名（6%）出现3级不良事件，16名接受自基因cevumeran治疗的患者中有1名（6%）出现3级不良事件。所有患者均耐受疫苗给药。
   • 免疫反应：8名患者（50%）在接种疫苗后产生了新抗原特异性T细胞反应，其中一半针对多个疫苗新抗原。疫苗扩增的T细胞占所有血液T细胞的最多10%，并在疫苗加强剂的作用下重新扩增，包括长寿命的多功能新抗原特异性效应CD8+ T细胞。
   • 临床结果：在18个月的中位随访期内，接种疫苗的患者（响应者）的无复发生存期中位数尚未达到，而未接种疫苗的患者（非响应者）为13.4个月（P=0.003）。响应者的血清CA19-9水平较低，且在疫苗接种后肝转移病灶消失，表明疫苗可能具有根除微转移的能力。
5. 总体结论：
   • 辅助自基因cevumeran疫苗联合atezolizumab和mFOLFIRINOX在50%的可切除PDAC患者中诱导了显著的新抗原特异性T细胞反应，并与延迟PDAC复发相关。
   • 这些初步结果表明，个性化RNA新抗原疫苗有潜力改善PDAC患者的预后，值得进一步研究。

二、文献精析

2-1：研究背景

1. 研究问题：这篇文章研究了个性化RNA新抗原疫苗在胰腺癌（PDAC）中的安全性和疗效。PDAC是一种高度致命的癌症，尽管手术是唯一的治愈性治疗方法，但大多数患者在手术后不久就会复发。
2. 研究难点：PDAC的低突变率导致其产生的新抗原较少，这使得针对PDAC的免疫疗法面临挑战。此外，PDAC对免疫检查点抑制剂的反应较差，进一步增加了治疗的难度。
3. 相关工作：已有研究表明，长期存活的PDAC患者体内存在自发的肿瘤特异性T细胞反应，这些反应可能与延迟疾病复发相关。然而，如何有效地诱导这些反应并转化为临床疗效仍是一个未解决的问题。

2-2：研究方法

这篇论文提出了一种基于尿苷mRNA-脂质纳米颗粒的个性化新抗原疫苗（autogene cevumeran），用于治疗手术后PDAC患者。

1. 新抗原疫苗的合成：从手术切除的PDAC肿瘤中实时合成mRNA新抗原疫苗。每个患者最多包含20个主要组织相容性复合体（MHC）I和MHC II限制的新抗原。
2. 治疗方案：手术后，依次给予患者atezolizumab（一种抗PD-L1免疫疗法）、autogene cevumeran和改良版的四药化疗方案（mFOLFIRINOX）。
3. 终点指标：疫苗诱导的新抗原特异性T细胞水平、18个月无复发生存率（RFS）和肿瘤学可行性。
4. 免疫反应检测：使用外周血样本，通过IFNy ELISpot试验检测疫苗诱导的高幅度T细胞反应，并使用TCR Vβ测序技术（CloneTrack）跟踪T细胞克隆的扩展和功能。

2-3：实验设计

1. 患者选择：招募了34名患者，其中28名患者接受了手术。19名患者接受了atezolizumab治疗，其中16名患者随后接受了autogene cevumeran治疗，15名患者同时接受了mFOLFIRINOX治疗。
2. 数据收集：在治疗期间和治疗结束后，定期收集患者的外周血样本，进行免疫反应检测和组织病理学分析。
3. 样本处理：从血液样本中纯化外周血单个核细胞（PBMCs），并使用密度离心法分离T细胞。激活T细胞并转导TCR基因，然后进行体外刺激和克隆扩增实验。

2-4：结果与分析

1. 安全性：在19名接受atezolizumab治疗的患者中，没有患者出现3级或更高的不良事件。16名接受autogene cevumeran治疗的患者中，有1名患者出现3级不良事件（发热和高血压）。

2. 免疫反应：通过IFNy ELISpot试验，检测到8名患者（50%）对疫苗产生了免疫反应。通过CloneTrack技术，发现疫苗诱导的T细胞克隆在患者中显著扩展，最高可达所有血液T细胞的10%。

   

3. 临床结果：在18个月的随访期内，接受疫苗扩展T细胞（响应者）的患者的无复发生存期（RFS）显著长于未接受疫苗扩展T细胞（非响应者）（中位数RFS分别为未达到和13.4个月，P=0.003）。

4. 机制分析：疫苗扩展的T细胞主要是CD8+T细胞，表达溶解性标记物和细胞因子，显示出效应T细胞的特征。这些细胞在疫苗接种后能够重新扩增，并在手术后长时间存活。

   

2-5：总体结论

这篇论文展示了个性化RNA新抗原疫苗在PDAC中的安全性和初步疗效。疫苗能够诱导高幅度的T细胞反应，并与延迟疾病复发相关。

尽管样本量较小，但这些结果支持了更大规模研究的必要性，以验证个性化mRNA新抗原疫苗在PDAC治疗中的潜力。

三、论文评价

3-1：优点与创新

1. 个性化疫苗设计：论文展示了一种基于尿苷mRNA脂质纳米颗粒的个性化新抗原疫苗，能够从手术切除的PDAC肿瘤中实时合成mRNA新抗原疫苗。
2. 多药联合治疗：研究结合了抗PD-L1免疫疗法（atezolizumab）、个性化新抗原疫苗（autogene cevumeran）和改良版的四药化疗方案（mFOLFIRINOX），展示了多药联合治疗的潜力。
3. 安全性与可行性：研究表明，该治疗方案在安全性、可行性和免疫原性方面表现良好，50%的患者在新抗原疫苗诱导下产生了显著的T细胞反应。
4. T细胞克隆追踪：开发了一种新的数学方法CloneTrack来追踪T细胞克隆，揭示了疫苗诱导的T细胞克隆的多样性和特异性。
5. 临床结果：在18个月的随访中，接种疫苗的患者（响应者）的无复发生存期显著长于未接种疫苗的患者（非响应者），表明疫苗诱导的T细胞活动可能与PDAC复发延迟相关。
6. 新抗原质量模型：提出了一种新抗原质量模型，用于评估新抗原的免疫原性，发现响应者的新抗原质量较高，可能更适合作为疫苗靶点。

3-2：不足与反思

1. 样本量有限：由于样本量较小，研究结果需要更大规模的研究来验证。
2. 缺乏多样性：研究仅纳入了白人患者，未来需要在不同种族和人群中进行更广泛的测试。
3. 快速整合到临床流程：尽管疫苗制造时间较短，但未来需要进一步优化，以便在更短的时间内将个性化mRNA疫苗整合到标准临床流程中。
4. 生物标志物选择：研究指出需要开发生物标志物来选择最佳患者和肿瘤进行治疗，未来需要进一步研究和验证这些生物标志物。
5. 多克隆T细胞的反应：尽管疫苗诱导了多克隆T细胞反应，但其持久性和对疾病控制的具体贡献仍需进一步研究。

四、重点关注

4-1：在研究中，如何检测和验证疫苗诱导的新抗原特异性T细胞反应？

在回答这个问题之前，先补充一个知识点——T细胞应答是控制肿瘤生长发育的最重要的宿主应答。

参与抗肿瘤免疫的两类T细胞亚群：

（1）CD8+细胞毒性T细胞（CTL），受MHC-I类抗原限制。

（2）CD4+辅助性T细胞（TH0），受MHC-Ⅱ类抗原限制。

（3）CD8+CTL杀伤肿瘤细胞的机制：

①通过其抗原受体识别肿瘤细胞上的特异性抗原，并在Th细胞的辅助下活化后直接杀伤肿瘤细胞；

②活化的CTL可分泌淋巴因子如γ干扰素、淋巴毒素等间接地杀伤肿瘤细胞。

（4）CD4+T杀伤肿瘤细胞的机制：

产生淋巴因子增强CTL的功能，激活巨噬细胞或其他APC，产生肿瘤坏死因子发挥溶瘤作用。

研究中使用了两种主要的方法来检测和验证疫苗诱导的新抗原特异性T细胞反应。

首先，通过外周血样本进行ELISpot试验，检测高幅度的T细胞反应。该试验不需要预先扩增T细胞，能够直接捕捉到疫苗诱导的T细胞反应。

其次，研究开发了CloneTrack方法，通过TCR Vβ测序来追踪T细胞克隆。这种方法可以识别和量化疫苗诱导的T细胞克隆的扩张情况，从而验证疫苗的免疫反应。

具体来说，CloneTrack方法利用T细胞受体（TCR）Vβ序列的测序数据，比较治疗前后的样本，检测T细胞克隆的扩张情况，确保这些克隆是由疫苗诱导的。

4-2：研究中使用的个性化mRNA新抗原疫苗是如何生产和制备的？

知识点补充：mRNA疫苗

mRNA疫苗的基本原理是通过特定的递送系统将表达抗原靶标的信使核糖核酸（mRNA）导入体内，在体内表达出蛋白（即抗原）并刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护。

这些抗原如同病原体的“蓝图”，能激活人体的免疫系统，产生对抗病毒或细菌的防御机制。与传统疫苗相比，mRNA疫苗不使用病原体本身或其成分（利用的是病毒的基因序列），因此没有感染风险，同时具备快速研发和生产的优势。

mRNA疫苗的关键特点包括：

1. 快速研发：由于mRNA疫苗是基于基因序列设计的，因此在新的病毒出现或病毒发生变异时，可以迅速更新疫苗设计，以应对新的威胁。

2. 双重免疫机制：mRNA疫苗能够同时激发体液免疫和细胞免疫，提供更全面的保护。体液免疫主要通过产生抗体来中和病原体，而细胞免疫则涉及T细胞的活化，直接攻击被感染的细胞。

3. 高免疫原性：mRNA疫苗能够高效地激活免疫系统，通常不需要额外的佐剂来增强免疫反应。

4. 易于批量生产：mRNA疫苗的成分相对简单，生产工艺标准化，易于规模化生产，有助于快速响应大规模的免疫需求。

5. 全球供应支持：由于其生产工艺的特点，mRNA疫苗能够支持全球范围内的疫苗供应，对于控制和预防传染病的全球传播具有重要意义。

mRNA疫苗技术的这些优势使其在近年来的疫苗研发中备受瞩目，尤其是在新冠疫情中，mRNA疫苗的研发和应用为全球抗疫做出了重要贡献。随着技术的不断进步和应用的扩大，mRNA疫苗有望在未来的疾病预防和治疗中发挥更大的作用。

个性化mRNA新抗原疫苗的生产和制备过程

首先，从手术切除的PDAC肿瘤组织中提取DNA和RNA。然后，通过全外显子测序和肿瘤RNA测序识别表达的非同义突变和HLA类型。接下来，生物信息学预测并排名新抗原，选择最具免疫原性的新抗原用于疫苗。

之后，在每个患者的情况下，个性化mRNA新抗原疫苗在良好生产规范条件下生产，包含优化翻译性能的尿苷基mRNA链。

每个患者最多包含20个主要组织相容性复合体（MHC）I和MHC II限制的新抗原，这些新抗原被包裹在直径约400纳米的脂质纳米颗粒中，以便于静脉注射。

4-3：研究中发现疫苗扩展的T细胞在患者体内的持久性和功能如何？

知识点补充1：T细胞活化的3个信号

T细胞在体内的激活一般可以分为三个阶段，分别经由不同的信号传导，如下图1所示。

在肿瘤免疫领域，T细胞的激活是免疫应答中至关重要的一环。T细胞的激活依赖于多个信号的协同作用，这些信号共同促进T细胞的增殖、分化和效应功能。

信号1：抗原识别（第一信号）

T细胞的激活始于其T细胞受体（TCR）对抗原肽-MHC分子复合物的识别。

这一过程是T细胞应答的起点，涉及T细胞与抗原提呈细胞（APC）之间的相互作用。TCR与CD3复合物共同构成了T细胞的抗原识别单元，当TCR结合到MHC分子所呈递的特定抗原肽段时，可以触发T细胞的激活。

此外，T细胞表面的CD4和CD8分子作为共受体，分别与MHC-II和MHC-I分子结合，增强T细胞与APC之间的相互作用，促进T细胞的激活。这一信号对于T细胞的初始激活至关重要，但它本身并不足以诱导T细胞的增殖和细胞因子的产生。

信号2：协同刺激（第二信号）

T细胞的完全激活还需要第二信号，即协同刺激信号，它由APC表面的协同刺激分子与T细胞表面的相应受体分子间的相互作用提供。CD28与B7分子（CD80和CD86）的结合是其中最为关键的协同刺激信号之一。

这一信号能够促进T细胞的增殖、细胞因子的产生，并防止T细胞的无能化。然而，值得注意的是，活化的T细胞表面表达的CTLA-4分子也能与B7分子结合，但其传递的是抑制性信号，有助于调节免疫应答的强度和持续时间。

缺乏第二信号的T细胞往往无法有效激活，最终可能进入无能状态或发生凋亡。

信号3：细胞因子的作用（第三信号）

第三信号主要由细胞因子提供，这些细胞因子在T细胞激活和增殖中发挥着至关重要的作用。例如，白细胞介素-2（IL-2）能够促进T细胞的克隆扩增，并诱导T细胞向效应T细胞和记忆T细胞的分化。

细胞因子不仅能够促进T细胞的存活和增殖，还能够调节T细胞的分化方向，影响免疫记忆的形成。

在肿瘤免疫治疗中，如何有效激活T细胞并克服肿瘤诱导的免疫耐受是一个重要挑战。

肿瘤细胞虽然能够通过MHC-I分子呈递肿瘤抗原，但往往缺乏必要的第二信号，导致T细胞无法被有效激活。因此，开发能够提供第二信号的免疫治疗策略，如树突状细胞（DC）疫苗，对于增强T细胞对肿瘤的免疫应答具有重要意义。

DC疫苗通过在体外激活和成熟DC细胞，再将其回输至患者体内，能够有效提供第一信号和第二信号，从而激活T细胞，增强抗肿瘤免疫应答。

此外，免疫检查点抑制剂、共刺激分子激动剂等新型免疫治疗手段也在临床上显示出了巨大的潜力。这些治疗策略通过解除T细胞的抑制信号或增强激活信号，提高T细胞对肿瘤的杀伤能力。随着对T细胞激活机制的深入理解，未来的肿瘤免疫治疗将更加精准和有效。

知识点补充2：T细胞体外扩增和培养理论依据

在体外扩增和培养T细胞的过程中，科学家们通过模拟T细胞激活的三个关键信号，成功地实现了T细胞的大量扩增。

第一信号的模拟：TCR/CD3的激活

为了在体外模拟T细胞的第一信号，科研人员常使用特异性的CD3抗体。

这些抗体能够与T细胞表面的TCR/CD3复合体结合，从而触发T细胞的激活。CD3抗体的结合导致T细胞表面免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs）的磷酸化，这一过程需要Lck和ZAP-70等激酶的参与。

这些激酶激活了下游的信号通路，包括MAPK、PI3K和NF-κB等，最终导致T细胞的激活和增殖。

第二信号的模拟：CD28的共刺激

在T细胞激活过程中，第二信号的提供至关重要。科研人员通过添加CD28抗体来模拟这一信号。

CD28抗体与T细胞表面的CD28受体结合，提供必要的共刺激信号，从而增强T细胞的活化和增殖。CD28的激活不仅促进了IL-2等细胞因子的产生，还增强了T细胞对IL-2的反应性，进一步推动了T细胞的扩增。

值得注意的是，CD28的激活还有助于T细胞向效应T细胞和记忆T细胞的分化，这对于免疫应答的长期维持至关重要。

第三信号的模拟：细胞因子的作用

在T细胞的体外培养中，细胞因子尤其是IL-2的使用对于T细胞的扩增至关重要。

IL-2是T细胞增殖的主要驱动力，它通过与T细胞表面的IL-2受体（IL-2R）结合，激活了JAK/STAT信号通路，促进T细胞的增殖和存活。在T细胞初次激活后，IL-2R的表达水平会上升，使得T细胞对IL-2变得更加敏感。然而，随着时间的推移，IL-2R的表达会逐渐下降，T细胞对IL-2的反应性也随之降低。

为了维持T细胞的长期培养，科研人员需要定期使用丝裂原或其他刺激物来维持T细胞的激活状态和IL-2R的表达。

在实际的体外培养过程中，科研人员会根据实验目的和需求，选择合适的刺激物和培养条件。

例如，为了获得具有特定功能的T细胞，可能会使用特定的细胞因子或抗体来引导T细胞的分化。此外，为了提高T细胞的扩增效率和存活率，科研人员还会优化培养基的成分，包括添加血清、细胞因子和其他营养物质。

总之，通过精确控制和模拟T细胞激活的三个信号，科研人员能够在体外有效地扩增和培养T细胞，为免疫学研究和临床应用提供了重要的工具和资源。

这些技术的应用不仅加深了我们对T细胞生物学的理解，也为开发新的免疫治疗方法提供了可能。

研究发现，疫苗扩展的T细胞在患者体内具有持久性和多功能性。

通过单细胞RNA测序，研究人员发现疫苗扩展的高幅度克隆是表达溶解标记和细胞因子的CD8+ T细胞。这些细胞在疫苗接种后重新扩增，并在手术后长达2年内保持在血液中，占所有血液T细胞的高达10%。

此外，这些T细胞在再次遇到疫苗抗原时表现出强烈的反应，显示出高效的记忆T细胞功能。这些结果表明，疫苗扩展的T细胞不仅在体内持久存在，而且具备强大的功能和记忆特性，有望在临床上发挥长期的免疫保护作用。